目的:探討內(nèi)皮細(xì)胞Yes相關(guān)蛋白(YAP)在小鼠下肢缺血后動(dòng)脈生成過(guò)程中的作用與機(jī)制。方法:缺氧處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),并使用Western blot檢測(cè)YAP第127位絲氨酸的磷酸化水平,采用免疫熒光染色檢測(cè)YAP的細(xì)胞亞定位情況;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs中YAP與缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)結(jié)合的情況;螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)YAP野生型(YAP-WT)質(zhì)粒以及YAP絲氨酸位點(diǎn)突變(YAP-5SA)質(zhì)粒對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié);構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞特異性YAP過(guò)表達(dá)(EC-YAPtg)小鼠,于結(jié)扎股動(dòng)脈手術(shù)后1、8、15和22 d使用激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠下肢血流恢復(fù)情況;免疫熒光染色檢測(cè)小鼠腓腸肌CD31、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及巨噬細(xì)胞分化抗原3(Mac3)的表達(dá)情況。結(jié)果:缺氧可以時(shí)間依賴性地下調(diào)YAP第127位絲氨酸的磷酸化,同時(shí)促進(jìn)YAP在細(xì)胞核定位;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí),YAP可以與HIF-1α在缺氧條件下相互結(jié)合;YAP-WT或者YAP-5SA均可以顯著增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性;與對(duì)照(YAPflox)小鼠相比,EC-YAPtg小鼠下肢...

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【部分圖文】：

圖1 缺氧降低YAP蛋白磷酸化水平并增加其核轉(zhuǎn)位

EC-YAPtg小鼠的構(gòu)建過(guò)程如圖4A所示。對(duì)EC-YAPTg小鼠和對(duì)照小鼠（YAPflox）行股動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)，分別于術(shù)后1、8、15和22d使用激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠下肢血流恢復(fù)情況。與YAPflox小鼠相比，EC-YAPtg小鼠下肢的血流灌注顯著增加（P<0.05），見(jiàn)圖....

圖2 YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結(jié)合

進(jìn)一步提取EC-YAPtg小鼠和YAPflox小鼠腓腸肌并且進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)CD31、α-SMA及Mac3表達(dá)水平。相比于YAPflox小鼠，EC-YAPtg小鼠肌肉中CD31和α-SMA表達(dá)明顯增高（P<0.05），而Mac3表達(dá)沒(méi)有明顯變化（P>0.05），見(jiàn)圖5。這....

圖3 YAP增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

圖2YAP蛋白和HIF-1α蛋白相互結(jié)合討論

圖4 YAP過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)下肢缺血后血流恢復(fù)

血管生成，即從已有血管網(wǎng)中形成新的血管，常見(jiàn)于發(fā)育過(guò)程中[16]；動(dòng)脈生成，是指現(xiàn)有的側(cè)支血管的擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞增殖后，平滑肌細(xì)胞有絲分裂，彈性層內(nèi)破裂，血管平滑肌細(xì)胞遷移形成新內(nèi)膜，一般見(jiàn)于出生后動(dòng)脈網(wǎng)的延伸或缺血損傷后天然微血管側(cè)支小動(dòng)脈轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ軇?dòng)脈等過(guò)程[17]。動(dòng)脈生成與....

本文編號(hào)：4016031