目的肺動(dòng)脈高壓（PAH）的特征性病理變化是肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）異常增殖,導(dǎo)致肺小動(dòng)脈管腔進(jìn)行性狹窄,兒童也是發(fā)生PAH的主要人群之一。Erk1/2的磷酸化與多種細(xì)胞的增殖相關(guān)。曲前列環(huán)素（Trep）近期已用于治療PAH,其機(jī)制需進(jìn)一步研究探討。本研究以PASMCs為研究對(duì)象,探討Trep對(duì)PAMSCs增殖的影響及Erk1/2磷酸化水平的變化,旨在探究治療PAH的新思路。方法復(fù)蘇PASMCs,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),免疫熒光方法鑒定細(xì)胞。使用不同濃度的血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）促進(jìn)PAMSCs增殖,找到合適濃度的PDGF建立增殖模型。先觀察Trep對(duì)PAMSCs增殖的影響并檢測(cè)Erk1/2磷酸化水平,實(shí)驗(yàn)分為:對(duì)照組,Trep組,PDGF組,PDGF+Trep組。顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活性,Western Blot法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、t-Erk1/2及p-Erk1/2蛋白表達(dá);再使用Erk1/2磷酸化抑制劑PD98059代替Trep,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),觀察PD98059對(duì)PAMSCs增殖的影響及Erk1/2磷酸化水平。結(jié)果（1）P... 

【文章來(lái)源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察以及α-SMA免疫熒光鑒定

圖 3.1 96 孔板示意圖Figure 3.1 schematic diagram of cell culture plate注意事項(xiàng)：在孔內(nèi)加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)品工作液以及 AB 工作液時(shí)，勿產(chǎn)生氣（9）分離膠與濃縮膠配制：取 1.5mm 規(guī)格玻璃板，使用雙蒸水洗凈后干燥，放入夾板中，向空隙內(nèi)加入雙蒸水檢漏 5 分鐘，若水平面下降不明表示不漏。檢漏后倒扣，再次待干燥。因本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白分子量在 30-5，故選用 12%SDS-PAGE 分離膠（下層膠，最佳分離范圍 12-60kD）。取 5杯，用雙蒸水洗凈后待自然干燥，加入 3mL 雙蒸水，6mL30%Acr-Bis，5 Tris（pH8.8），0.15mL 10% SDS，0.15mL 10%過(guò)硫酸銨，輕輕攪拌混勻取 0.006mLTEMED 加入上述混合液中，再次攪拌，加入玻璃板縫隙中，入異丙醇覆蓋。待下層膠凝固后（室溫下約 1 小時(shí)），配制濃縮膠（上層 50mL 燒杯，用雙蒸水洗凈后待自然干燥，加入 4.1mL 雙蒸水，1mL30%

出梳子時(shí)需垂直向上，勿左右晃動(dòng)；孔內(nèi)加電轉(zhuǎn)：裁剪合適大小的 PVDF 膜，并做好標(biāo)醇中備用，將 2 片轉(zhuǎn)膜濾紙浸泡于 1×電轉(zhuǎn)出玻璃板，浸泡于 1×電轉(zhuǎn)液中，使用小塑料片轉(zhuǎn)膜濾紙上，使用光滑玻璃棒擠去凝膠與 PVDF 膜，將 PVDF 膜放置于轉(zhuǎn)膜濾紙上，膠之間的氣泡擠去。將另一片轉(zhuǎn)膜濾紙覆蓋氣泡。按圖 3.3 所示將夾板夾緊（從上至下—PVDF 膜——凝膠——轉(zhuǎn)膜濾紙——黑入適當(dāng)?shù)?4℃1×電轉(zhuǎn)液，并放入冰盒，并在，注意正負(fù)極。將參數(shù)設(shè)置為電流 300mA內(nèi)開(kāi)始電轉(zhuǎn)。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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