心血管疾病是在全世界死亡率和發(fā)病率最高的一個疾病之一。在我國，肥胖和高血壓人口達2億6千萬，每年有300萬人死于心腦血管疾病，尤其是動脈粥樣硬化。我國居民攝食油脂較高，遠超過了營養(yǎng)學會推薦的水平。氫化油做為食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸的含量較高。研究表明，高TFAs攝入除了通過升高血清LDL和TG，引起血管內(nèi)皮損傷外，還可提高可溶性細胞間黏附分子－1（SICAM-1）、可溶性血管細胞黏附分子－1（SVCAM-1）和E－選擇素（E-selectin）的表達。雖然有很多研究都報道了TFAs與心血管疾病有關系，但TFAs對血管的影響機制尚不清楚。有學者發(fā)現(xiàn)廣泛存在于中國日常膳食中的反油酸（9t18:1）和反亞油酸（9t12t18:2）能通過Caspase途徑誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡、促進內(nèi)膜炎性因子釋放。流行病學研究已經(jīng)證實這兩種TFAs誘導動脈粥樣硬化（AS）程度具有顯著差異。近年來的研究表明，脂筏內(nèi)富含脂類和一些與細胞信號轉(zhuǎn)導有關的組分，這可能就為信號轉(zhuǎn)導的有效進行和各種信號轉(zhuǎn)導途徑的“cross talk”提供平臺。已有文章報道，多不飽和脂肪酸如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等可以改變脂筏結構，DHA還可改變脂筏脂肪環(huán)境調(diào)節(jié)白細胞介素2受體信號通路。因此猜測TFAs對細胞的影響可能與脂筏結構有關，一方面可能通過改變脂筏脂肪酸和磷脂組成而影響細胞，一方面可能通過刺激脂筏上受體而誘導細胞凋亡。本研究將對比用脂筏破壞劑破壞細胞膜脂筏與否，TFAs對細胞信號的影響，探討脂筏及其受體在TFAs引起細胞凋亡中的重要作用，為我國心血管疾病的病因及其防治提供科學依據(jù)。 本研究首先建立脂筏破壞模型，確定脂筏破壞劑的合理作用時間，在不引起細胞形態(tài)及生理指標變化的情況下，采用MTT法觀察9t18:1和9t12t18:2對內(nèi)皮細胞活力的影響，通過流式細胞術檢測TFAs對細胞凋亡和周期的影響，進一步通過Western-Blot分析TFAs對凋亡相關蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）和周期相關蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表達量的影響，探討脂筏對TFAs誘導細胞凋亡及周期變化的影響。根據(jù)前期結果，通過Western-Blot分析脂筏上凋亡受體表達，再運用熒光顯微鏡觀察脂筏上受體變化，最后通過高效氣相色譜法分析TFAs對細胞脂肪酸組成的影響，得到反油酸誘導細胞凋亡的受體通路。與此同時，通過以上方法和指標對比了脂筏在不同飽和度TFAs誘導細胞生理變化中的介導作用。主要取得如下研究成果： 1.成功建立脂筏破壞模型。脂筏破壞劑MβCD在作用濃度為10mM時，其不引起人臍靜脈內(nèi)皮細胞活力發(fā)生顯著變化的時間為60min以內(nèi)，超過60min內(nèi)皮細胞微觀形態(tài)開始改變，甚至細胞死亡。在40min時細胞膜膽固醇含量有明顯減低，在50min時脂筏的標志蛋白（小窩蛋白）表達量有顯著下降，說明在40-60min時，MβCD即可去除脂筏又不會影響細胞的生理功能，因此確定脂筏破壞劑作用濃度為10mM，作用時間為50min。 2.脂筏參與TFAs誘導的細胞凋亡。TFAs可降低細胞活力，促使細胞凋亡。但TFA作用于去除脂筏的內(nèi)皮細胞時，細胞活力下降減少，凋亡細胞數(shù)降低，凋亡相關蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）表達量下降，且同濃度（50μmol/L）的9t12t18:2對上述指標降低能力比9t18:1大，說明脂筏參與了TFAs誘導的細胞凋亡，且對9t12t18:2引起的凋亡能力更大。 3.脂筏參與TFAs誘導的細胞周期改變。當脂筏功能受干擾后，9t18:1和9t12t18:2均能促進內(nèi)皮細胞由G0/G1期進入S期，使處于增殖期的細胞數(shù)量百分比明顯增加；對周期相關蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表達量也有顯著影響。 4.9t18:1和9t12t18:2均能增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等炎癥因子表達量，同濃度下反亞油酸促炎效果更強；去除脂筏后，炎癥因子表達顯著降低，說明破壞脂筏對炎癥有抑制作用。 5.9t18:1作用于內(nèi)皮細胞，可使凋亡受體Fas聚集在細胞膜上，當去除脂筏后，凋亡受體及配體表達下降，其下游凋亡蛋白表達也降低，由此推測反油酸作用于細胞脂筏，刺激Fas受體與其FasL配體結合，并激活下游凋亡通路，引起細胞凋亡。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R54
【部分圖文】：

Fig. 1.1 The possible pathway of TFAs induced vascular cell injury上游信號受體還未知，TFAs 是否通過細胞膜上蛋白受體胞周期、細胞凋亡和炎癥通路及其他信號通路尚不得而知可見，膳食中 TFAs 含量及攝入量將誘發(fā)心血管疾病特別發(fā)展，通過研究不同飽和度的 TFAs 對血管壁細胞的影響

圖 1.2 脂筏組成及結構Fig. 1.2 Composition and structure of lipid rafts1.3.2 脂筏的信號轉(zhuǎn)導功能觀察研究發(fā)現(xiàn)，脂筏上存在多種與信號轉(zhuǎn)導有關的特殊蛋白質(zhì)，使其參

圖 2.1 MβCD 不同作用時間對 HUVEC 活力的影響Fig.2.1 Effect of different MβCD reaction time on cell viability of HUVEC注：數(shù)據(jù)表示為X ±SD，n=6，無 MβCD 作用時細胞存活率設為 100%，*表示有顯著差異（p<0.05）.4.2 MβCD 不同作用時間對 HUVEC 微觀形態(tài)的影響
【參考文獻】

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本文編號：2890669