第一部分重型血友病甲患者的基因診斷及發(fā)病機制研究【目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)為一種X染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病,在男性人群中發(fā)病率為1/5000,女性患者極為罕見�；颊咦杂卓捎蟹磸偷年P節(jié)出血,嚴重者可發(fā)生腦出血危及生命。根據(jù)血漿中凝血因子VIII活性(FVIII:C)的不同將其分為輕、中、重三型。目前針對本病的治療主要依賴濃縮凝血因子VIII替代治療,尤其對于重型血友病患者來說,治療費用大,生活質(zhì)量差,所以對血友病患者家系及時進行基因檢測,及早的發(fā)現(xiàn)攜帶者,可以有效的減少血友病患兒的誕生�！痉椒ā繉�2009年至2014年期間在蘇州大學附屬第一醫(yī)院血友病中心就診的43例重型血友病甲男性患者進行FVIII基因突變的檢測,其中用長距離PCR法檢測22號內(nèi)含子倒位,雙管PCR法檢測1號內(nèi)含子倒位,以及FVIII基因26個外顯子及其側翼序列的直接測序并將測序結果和NCBI基因庫(genebank)所公布的FVIII(NM.000132.3)基因序列進比對,尋找基因突變,并排除多態(tài)性�！窘Y果】43例患者中,21例患者發(fā)現(xiàn)22號內(nèi)含子倒位(占48.8%),1號內(nèi)含子突變未發(fā)現(xiàn)。余下22例患者均發(fā)現(xiàn)基因突變位點,共有21種突變,其中點突變13例,小片段缺失7例(其中2例為同種突變),小片段插入2例;其中導致氨基酸錯義突變5例,無義突變6例,移碼突變9例,剪接位點突變2例。其中7種基因突變國際上未見報到,為首次發(fā)現(xiàn)。分別為:c.214GT(E72X),c.215TC(F73S),IVS5+2GA(splicing),c.2519CG(S840X),c.3180del A(V1061Xfs),c.5639del A(N1880Tfs*3),c.6572del A(N2191Mfs*18)�！窘Y論】43例HA患者的基因分析表明FVIII基因突變具有明顯的異質(zhì)性,22號內(nèi)含子倒位是重型血友病A患者的主要突變方式。通過分析7例新的突變的發(fā)病機制,對血友病A發(fā)病機制的的進一步研究提供了基礎,血友病甲攜帶者及孕婦進行快速、準確的診斷打下了基礎。第二部分重型血友病A患者凝血因子VIII抑制物檢測及其產(chǎn)生影響因素的分析【研究目的】血友病甲(Hemophilia A,HA)是由于凝血因子VIII(FVIII)基因缺陷,導致的血漿FVIII質(zhì)或量的異常而引起的一種X染色體連鎖的隱形遺傳性出血性疾病。目前本病主要治療方法為FVIII制劑的替代治療,而FVIII抑制物是血友病A患者反復輸注FVIII制劑后產(chǎn)生的一種同種抗體,有中和并完全滅活FVIII活性的作用,是血友病A患者發(fā)生的最嚴重的并發(fā)癥。近年來隨著血友病替代治療的不斷推廣,重型HA患者接受替代治療的強度較以往大大增加,因此抑制物的防治也越來越得到重視,在本研究中我們對2004年至2014年期間在我院確診的重型血友病患者進行抑制物產(chǎn)生影響因素的分析,旨在指導臨床上重型血友病A患者的治療�！痉椒ā渴占�2009年至2014年期間在蘇州大學附屬一院血友病中心確診的43例重型血友病甲(HA)男性患者外周血樣本,運用Nijmegen改良的Bethesda方法對43例患者進行FVIII抑制物的檢測。進一步分析患者抑制物的發(fā)生與首次接受替代治療的年齡、暴露日、FVIII基因突變類型因素的相關性�！窘Y果】43例男性重型血友病A患者,首次接受替代治療的年齡1歲組的14例(32.6%),1~5歲組22例(51.2%),≥5歲組7例(16.3%)。暴露日10ED組的患者15例(34.9%),10~50ED組8例(18.6%),≥50ED組20(46.5%)例。43例患者中抑制物陽性患者9例(占20.9%),中位抑制物滴度0.82BU(0~14BU),陰性患者34例(占79.1%)。FVIII基因突變類型中無效突變38例(88.4%),非無效突變5例(11.6%)。對43例接受過替代治療的重型血友病A患者進行發(fā)生抑制物的單因素及多因素分析,在觀察的諸多因素中,包括首次替代治療年齡、暴露日及突變類型與患者是否出現(xiàn)抑制物差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)�！居懻摗垦巡』颊咭种莆锂a(chǎn)生的影響因素眾多,如何能夠有效的減少抑制物的發(fā)生,仍然需要進行不斷的大樣本研究。如能根據(jù)發(fā)生抑制物的危險程度,對血友病患者進行分層治療將會更加有意義。第三部分凝血因子IX酶催化區(qū)突變致女性血友病乙一例試驗研究【研究目的】血友病乙(Hemophilia B,HB)是一種X連鎖隱性遺傳性出血性疾病,多為男性發(fā)病,女性血友病乙患者罕見,本研究對一例女性血友病乙患者進行表型和基因型分析,探討其發(fā)病機制�！痉椒ā繉σ焕匝巡∫蚁茸C者、其父母及其女兒進行血漿部分活化凝血酶原時間(APTT)、凝血酶原時間(PT),血漿凝血因子IX活性(FIX:C),血漿凝血因子VIII活性(FVIII:C)測定,并進行FIX抑制物活性測定;運用PCR技術對先證者及其父母、女兒的FIX基因的所有外顯子及其側翼序列進行PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)測序分析并尋找突變位點;對先證者及其父母運用多重熒光PCR技術檢測16個STR位點進行親子分析。用Western blot的方法檢測患者血漿中FIX蛋白含量。在HEK293細胞中分別轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及突變型/野生型雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,繼而使用Western blot的方法檢測細胞上清液及裂解液的FIX蛋白含量。通過PCR聯(lián)合甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶Hha I酶切PCR產(chǎn)物的方法檢測ZNF261基因上的甲基化位點,檢測患者是否存在X染色體非隨機失活�！窘Y果】先證者因頭部外傷后顱內(nèi)血腫入院,既往有產(chǎn)后出血過多及術后出血難止病史。父母非近親結婚,均無出血病史。先證者血漿APTT 62.2s,PT 13.9s,FIX:C 2%,FVIII:C148%,FIX抑制物陰性;患者父母、女兒血漿APTT、PT、FIX:C、FVIII:C均正常。FIX基因分析發(fā)現(xiàn),先證者FIX基因的8號外顯子存在T1108G(Phe314Cys)雜合突變,已排除基因多態(tài)性,且此突變國際上尚無報道;患者父母及女兒FIX基因測序結果均正常。STR分析證實先證者與其父母為親子關系�；颊哐獫{中存在FIX蛋白,與正常人相比無明顯差別。體外表達實驗發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染野生型F9WT質(zhì)粒的細胞與轉(zhuǎn)染F9MT(Phe314Cys)質(zhì)粒的細胞以及F9WT/F9MT雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的細胞,進行比較,表達上清中及細胞裂解液中FIX蛋白的含量無明顯差別。X染色體非隨機失活實驗證實患者來源于母親的X染色體發(fā)生了甲基化不能被酶切,而來源于父親的X染色體被完全酶切�！居懻摗垦巡∫覟閄染色體連鎖隱性遺傳性出血疾病,女性罕見,女性發(fā)病機制主要是X染色體的非隨機失活、X染色體的結構異�；騀IX基因的純合突變所致。先證者臨床特點及表型檢測結果符合血友病乙,基因分析結果證實先證者的FIX基因8號外顯子存在T36029G(Phe314Cys)雜合突變,突變位于酶催化區(qū)域,該突變導致患者血漿中FIX活性下降,但并未影響FIX蛋白的表達與分泌�；颊吒改阁w細胞檢測未發(fā)現(xiàn)FIX突變,且患者來源于母親的X染色體完全甲基化失活,因此我們推測患者FIX雜合突變來源于父親的精原細胞突變。
【學位單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R554.1
【部分圖文】：

2號內(nèi)含子倒位圖

倒位陰性的22例患者基因突變圖

Phe314Cys)表達載體的構建設計：以 PcDNA3.1F9WT 質(zhì)粒為 PCR 擴增模板，設計：5'-GCTGGGGAAGAGTCTGCCACAAAGGGAGATCTCCCTTTGTGGCAGACTCTTCCCCAG-3'（劃橫線 定點誘變 ： PCR 反應體系：總體積 20μl ，包 0.4μl,10μm 的上下游引物各 1μl，F(xiàn)9WT DNA 0μl，Phusion 酶 0.2μl（New England Biolabs 公司產(chǎn)品件為：98℃變性 30s，98℃變性 10 s，70.7℃退火 30 s；最后 72℃延伸 l0min。取 2μl 的 PCR 擴增產(chǎn)物在 0.圖 3-1 PcDNA3.1(-)表達載體
【參考文獻】

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1 劉敬忠,劉強,梁燕,王立榮,ＧｕｉｔｙＮｏｚａｒｙ,肖白,朱章菱,周艷,劉亮,張晶,ＳｔｅｖｅＳ．Ｓｏｍｍｅｒ;重型血友病甲基因診斷新技術的研究及其應用[J];高技術通訊;1998年09期

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本文編號：2890340