研究背景和研究目的動脈粥樣硬化(AS)是引發(fā)人類心腦血管疾病的重要病因,也是全球范圍內的研究熱點和臨床上亟需解決的難題之一。AS是發(fā)生于大中型動脈的慢性退行性病變,主要特征為血管內皮功能異�；驌p傷,伴脂質沉積,多種炎性細胞和炎性因子共同參與,最終導致粥樣斑塊形成致使動脈管壁硬化,管腔狹窄繼而引起靶器官缺血性的改變和相應癥狀。動脈粥樣硬化的機制復雜至今仍未完全闡明。AS的過程始于血管內皮細胞的損傷或功能異常,并在內皮表面黏附分子(E-selectin、P-selectin、ICAM-1、VCAM-1)、趨化因子(MCP-1、IL-8 等)、多種炎癥細胞(T淋巴細胞、單核巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞等)、炎癥因子(IL-1、IL6、TNF-α、CRP、Lp-PLA2 等)和多種基質蛋白酶(MMPs、ASAMTSs、cathepsins等)的共同參與下發(fā)生發(fā)展。隨著脂質核的形成擴大和斑塊內炎癥反應的加劇,斑塊內發(fā)生巨噬細胞、平滑肌細胞的凋亡、血管新生、纖維帽和細胞外基質的降解,促進了斑塊失穩(wěn)定性至最終破裂的過程。由此可見,炎癥參與并貫穿了斑塊發(fā)生、發(fā)展、去穩(wěn)定和最終破裂的整個過程。急性冠脈綜合征(ACS)是一組因心肌急性缺血所引發(fā)的臨床綜合征,主要包括①不穩(wěn)定性心絞痛(UAP)、②非ST段抬高型心肌梗死、③ST段抬高型心肌梗死(STEMI)。ACS患者作為冠心病患者中的高危人群,雖然近些年來藥物治療的優(yōu)化和溶栓介入的開展已經(jīng)極大地降低了 ACS患者的死亡率,但是其院內和院外發(fā)生短期和長期不良心血管事件的風險依然很高,因而對其早期進行風險評估和強化治療管理在臨床上顯得尤為重要。GRACE評分和TIMI評分對ACS患者的風險評估已經(jīng)深入人心,并得到了多項大型臨床試驗的驗證和指南的推薦20 21。GRACE評分主要通過患者的年齡、靜息心率、血肌酐水平、收縮壓、心衰病史、心肌梗死病史、ST段壓低、心肌酶升高、院內是否血運重建這9項指標對ACS患者進行評分。目前的研究表明GRACE評分對ACS患者院內死亡率以及院外的短期預后和長期預后均有較好的預測價值。ACS的病理學基礎是冠脈內不穩(wěn)定斑塊的破裂或者發(fā)生糜爛后繼發(fā)血栓形成。不穩(wěn)定斑塊一般伴有如下特點:大量巨噬細胞和炎性細胞浸潤,平滑肌成分較少,薄纖維帽(厚度小于65 μm),大壞死核(大于斑塊體積的30%),斑塊內血管新生和/或斑塊內出血,血管擴張性正性重塑,血栓形成。動物模型中常通過計算易損指數(shù)來反映斑塊的易損性。臨床上有多種影像學檢查來檢測斑塊的不穩(wěn)定性:如多層螺旋CT(MDCT)、光學相干斷層掃描技術(OCT)、頸動脈超聲和血管內超聲(IVUS)。臨床上一直以來都將冠脈造影視為冠心病確診的金標準。通過對造影顯示的冠脈內斑塊形態(tài)的直觀觀察也可以粗略有效地反應斑塊的穩(wěn)定性。相關研究表明冠脈造影診斷的復雜病變可以較好地反應斑塊的易損性并對冠心病患者的預后有獨立診斷價值。目前已有多項臨床研究通過分析外周血炎癥因子的表達與冠脈復雜病變的關系來尋找反映斑塊穩(wěn)定性的血清標志物。Mac-2結合蛋白(M2BP)是一種分泌型的高度糖基化蛋白,也是巨噬細胞清道夫受體富含半胱氨酸域超家族成員之一。M2BP在造血細胞和上皮細胞中表達,多種其他組織也可以表達M2BP,例如結腸組織、十二指腸、胃組織和肺臟,并且在人體的多種體液中也可以檢測到M2BP的存在,例如精液、尿液、淚液、乳汁和血漿。M2BP作為一種致炎性蛋白在腫瘤和病毒感染時表達增高并被多項研究證實與腫瘤的轉移和預后密切相關。近年來的研究表明M2BP可以激活人單核細胞并上調炎癥因子的表達,參與了機體的細胞免疫應答。并且研究發(fā)現(xiàn)相較于健康個體,M2BP的血漿水平在冠心病患者中是顯著升高的,且和冠心病危險因素、機體的代謝、氧化應激水平密切相關。一項最新的研究證實了 M2BP在人體冠脈斑塊中與CD68陽性的巨噬細胞共表達并且在致炎性的M1性巨噬細胞中高表達。另外,一項回顧性研究表明M2BP對冠脈CT診斷的149名冠心病患者的長期死亡率有獨立預測價值。鑒于M2BP的炎性特征以及其在動脈硬化和冠心病領域的相關研究,我們猜測M2BP參與了動脈硬化和斑塊去穩(wěn)定性的過程。后續(xù)的研究中我們將通過臨床觀察與基礎研究相結合的方式深入地探討M2BP在動脈硬化和斑塊去穩(wěn)定性中的作用及相關機制,進而為冠心病的病理機制提供新的理論依據(jù)和治療靶點。研究內容1.比較M2BP在冠心病患者(ACS、SAP)和對照組(control)外周血中的表達,同時分析其表達水平與冠脈復雜病變的相關性,并且探討血漿M2BP水平在ACS患者中的預后價值。2.分析比較M2BP在冠心病患者(ACS、SAP)和對照組(control)外周血單個核細胞(PBMC)中的mRNA表達差異及與多種炎癥因子表達的相關性,最后分析M2BP在PBMC中表達水平對冠脈復雜病變的診斷價值。3.連續(xù)入選51名頸動脈內膜切除患者,結合患者癥狀和頸動脈超聲情況,分析M2BP在癥狀性患者和不穩(wěn)定斑塊內的表達。4.體內動物實驗通過慢病毒載體介導M2BP的沉默,觀察M2BP沉默對ApoE敲除小鼠斑塊形成和斑塊內成分的影響。5.體外細胞實驗通過重組蛋白刺激探討M2BP對THP-1和HUVEC細胞內炎癥因子的調控及相關機制。研究方法1.M2BP在冠心病患者外周血的表達及其在ACS患者中預后價值研究連續(xù)入選從2015年1月到12月入住我院接受冠脈造影的患者共348名,其中包括急性冠脈綜合征(ACS)患者216名,穩(wěn)定型心絞痛(SAP)患者82名,還有對照組(controls)50名。入院后常規(guī)采集病史并靜脈采集外周血離心后取上清用于M2BP的Elisa檢測。由我院心內科專家分析患者的冠脈造影的靶血管造影形態(tài)和管腔狹窄程度,按照Ambrose's分類法分為簡單病變和復雜病變。并隨機選取SAP病人30名于術前和術后多個時間點(1h、2h、6h和24h)采靜脈血用于M2BP的檢測。對ACS患者,入院即進行GRACE評分和危險分層,并隨訪一年。隨訪終點事件為復合終點(major adverse cardiovascular outcomes,MACE),包括心源性死亡,非致死性心肌梗死,再發(fā)心絞痛入院。建立Cox多因素模型篩選ACS患者預后的獨立危險因素。2.M2BP在冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及對復雜斑塊的預測價值研究隨機入選從2016年1月到3月入住我院接受冠脈造影患者共60名,其中包括急性冠脈綜合征(ACS)患者40名,穩(wěn)定型心絞痛(SAP)患者20名,另匹配健康對照組(controls)10名。入院后常規(guī)采集病史并抽取外周血Elisa檢測炎癥因子(hs-CRP、IL-6、TNF-α)表達,Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)并RT-PCR檢測M2BP和其他炎癥因子的mRNA表達水平。通過造影分析按照Ambrose's分類法分為簡單病變和復雜病變。所有患者出院后一個月門診隨訪時抽取外周血提取PBMC做M2BP的RT-PCR檢測與入院時比較。建立Logistic多因素模型和ROC曲線判斷M2BP在PBMC中的mRNA表達對冠脈復雜病變的預測價值。3.M2BP在人體頸動脈斑塊中的表達及其與斑塊去穩(wěn)定性的相關研究連續(xù)入選我院接受頸動脈內膜切除術的患者共51名,根據(jù)其近6個月來有無缺血癥狀(腦卒中stroke、短暫性腦缺血發(fā)作TIA和一過性黑矇amaurosis fugax)分為癥狀性斑塊和無癥狀性斑塊。根據(jù)頸動脈超聲分為無回聲斑塊、異質性斑塊和強回聲斑塊�；颊呷朐汉蟪Ｒ�(guī)集病史并抽取外周血Elisa檢測M2BP。切除的頸動脈斑塊部分用于M2BP的RT-PCR檢測,部分用于免疫組化染色(M2BP、CD68 和 α-smooth muscle actin)和 Masson 染色。Image pro plus 軟件分析陽性染色面積。從外周血、斑塊內mRNA表達和斑塊內染色面積三個水平分析比較M2BP的表達與超聲、癥狀、斑塊內成分的關系。4.M2BP對斑塊形成和穩(wěn)定性的影響及其炎性調控機制的基礎研究4.1 M2BP對斑塊形成和穩(wěn)定性影響的體內研究60只8周齡雄性ApoE-/-小鼠適應性喂養(yǎng)2周后過渡到高脂飲食,高脂喂養(yǎng)8周后,將小鼠隨機分為三組①PBS對照組(陰性對照組,n=20,尾靜脈注入200ul的PBS)②空載體對照組(Lenti-null組,n=20,尾靜脈注射200ul含有107TU的空載體慢病毒)③慢病毒沉默組(Lenti-M2BP組,n=20,尾靜脈注射200ul含有107TU的M2BP沉默慢病毒)。注射完慢病毒后所有小鼠繼續(xù)高脂喂養(yǎng)4周后麻醉處死。眼球取血后離心分離上清用于血脂和M2BP的Elisa檢測。小鼠心臟浸泡于4%多聚甲醛過夜后部分OCT包埋制作冰凍切片用于主動脈根部油紅染色,部分石蠟包埋制作石蠟切片,用于主動脈根部HE、天狼猩紅和免疫組化染色(α-SMC、CD68、IL-6、MCP-1、ICAM-1、Lp-PLA2、MMP2、MMP9)。自升主動脈致腹主動脈分離主動脈全長,部分用于Western Blot和RT-PCR,部分用于大體油紅0染色。Image pro plus軟件分析比較各組小鼠染色面積,計算斑塊的易損指數(shù)。4.2 M2BP炎性調控機制的體外研究1)以 不 同濃度的 ox-LDL(0、10、20、40、80μg/ml)刺激 THP-1 細胞 6 小時和24小時,取上清用于M2BP的Elisa檢測。2)以 不同的炎癥因子(ox-LDL20μg/ml、IL-1β10ng/ml、TNF-α10ng/ml)單一刺激或聯(lián)合刺激THP-1細胞6小時和24小時,取上清用于M2BP的El isa檢測。3)以不同的炎癥因子(ox-LDL20μg/ml、IL-1β1Ong/ml、TNF-α 10ng/ml)單一刺激或聯(lián)合刺激HUVEC細胞24小時,取上清用于M2BP的Elisa檢測。4)以不同濃度的 rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激 THP-1 細胞 6 小時和24小時,Elisa檢測培養(yǎng)基中炎癥因子IL-6,IL-8,TNF-α,MMP-9,Lp-PLA2的表達。5)分別以不同濃度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5 u g/ml)刺激HUVEC細胞24小時,elisa檢測培養(yǎng)基中IL-8和MCP-1的表達。6)分別以不同濃度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激HUVEC細胞6小時,Western blot 檢測黏附分子ICAM-1、VCAM-1 和 E-selectin 的表達。7)細胞黏附實驗檢測不同濃度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5μg/ml)刺激對THP-1細胞與HUVEC細胞的黏附作用的影響。8)Transwell趨化實驗檢測不同濃度的rhM2BP(0、0.1、0.5、1、5 μ g/ml)刺激對THP-1細胞趨化作用的影響9)研究重組蛋白rhM2BP刺激對THP-1細胞內MMP9和MMP2表達和活性的時間依賴性和濃度依賴性的影響并通過相應的通路抑制劑預刺激研究NF-kB和MAPK信號通路是否參與了 rhM2BP對MMP9和MMP2的調控。研究結果1.M2BP在冠心病患者外周血的表達及其在ACS患者中預后價值研究相比于對照組,SAP組和ACS組的患者有更多的冠心病危險因素(吸煙、糖尿病、高脂血癥)。CAD組患者M2BP水平明顯高于Control組的患者(p0.0.01),UAP組患者外周血M2BP水平明顯高于SAP組和Control組(p0.001),而在ACS患者中,NSTEMI、STEMI患者的M2BP水平與UAP組患者相比并沒有顯著統(tǒng)計學差異。Spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)ACS患者外周血M2BP水平與hs-TnT沒有顯著的相關性(r=0.081,p=0.240)。而在ACS患者中,外周血的M2BP水平與GRACE評分具有良好的相關性(r=0.218,p=0.001),并且與GRACE評分危險分層呈正相關。SAP患者PCI術后1小時外周血M2BP顯著升高,后逐漸下降,24h下降至基線水平。CAD患者外周血M2BP水平與冠脈病變支數(shù)無明顯相關性。而通過對ACS患者冠脈造影的分析我們發(fā)現(xiàn),其外周血M2BP的水平與冠脈復雜病變的支數(shù)(程度)成正相關(p0.001)。在對216名ACS患者為期1年(11.7±2.7months)的隨訪中,共發(fā)生了 45(20.8%)例MACE事件。事件組的ACS患者外周血M2BP顯著高于非事件組患者(p0.001)。Cox多因素模型在調整了其他臨床危險因素后,M2BP對ACS患者的預后仍然有獨立預測價值。并且血漿M2BP聯(lián)合GRACE評分能提高對ACS患者預后的診斷價值。2.M2BP在冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及對復雜斑塊的預測價值研究ACS患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表達顯著高于SAP和Control組(p0.001),并且在急性期表達水平明顯高于慢性穩(wěn)定期(p0.001)。Spearman相關性分析顯示:冠心病患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表達與外周血血漿中炎癥因子的表達以及外周血PBMC中炎癥因子的mRNA表達呈顯著正相關。冠脈復雜病變(n=48)的CAD患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表達顯著高于冠脈簡單病變(n=12)的CAD患者(p=0.004)。并且CAD患者外周血PBMC中M2BP的mRNA表達與冠脈復雜病變的數(shù)目有明顯的相關性。ROC曲線分析示在本研究隊列中,PBMC中M2BP的mRNA表達水平對復雜病變的診斷價值明顯高于血漿hs-CRP(曲線下面積AUC:0.696 vs 0.588,p=0.109)。Logistic多因素分析在進行多個危險因素的調整后,PBMC中的M2BP的mRNA表達仍然對冠脈復雜病變有獨立預測價值(OR=2.586,95%CI=1.124-5.948,p=0.025).3.M2BP在人體頸動脈斑塊中的表達及其與斑塊去穩(wěn)定性的相關研究M2BP在頸動脈斑塊內的細胞核、細胞質和細胞外間質中均有表達,且作為分泌性因子其主要分布于細胞外間質。連續(xù)切片免疫組化染色顯示M2BP在人體頸動脈斑塊內與巨噬細胞共定位表達,而在平滑肌細胞中幾乎不表達。M2BP在破裂的Ⅲ型斑塊中和擁有脂質核的Ⅱ型斑塊中是高表達的,在Ⅰ型纖維斑塊中是低表達的。并且M2BP在斑塊肩部、壞死核內、破裂的纖維帽部位這些易損位點均是高表達的,在完整的纖維帽上和斑塊內的纖維組織中是弱表達的。M2BP在癥狀性患者中表達高于無癥狀性患者,并且隨著最近發(fā)作的癥狀發(fā)生時間的增加其表達水平呈現(xiàn)下降趨勢。另外,其在TIA和stroke患者中表達高于在黑矇患者中的表達,在無回聲斑塊和異質性回聲斑塊中的表達高于強回聲斑塊中的表達。Spearman相關性分析示:M2BP的陽性染色面積與CD68巨噬細胞陽性染色面積成正比(p=0.374,r=0.007),與TUNEL陽性染色面積成正比(r=0.329,p=0.018),與平滑肌SMC陽性染色面積(r=-0.309,p=0.027)以及膠原染色面積(r=-0.304,p=0.030)成反比。4.M2BP對斑塊形成和穩(wěn)定性的影響及其炎性調控機制的基礎研究4.1 M2BP對斑塊形成和穩(wěn)定性影響的體內研究實驗完成時三組小鼠的體重和血脂含量(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇以及高密度脂蛋白膽固醇)無顯著差異。慢病毒轉染后血清Elisa顯示lent i-M2BP組M2BP水平相比于空病毒組和PBS組明顯降低(p0.05)。免疫組化、Western blot和RT-PCR顯示lenti-M2BP組M2BP的蛋白和基因表達水平相比于空病毒組和PBS組明顯降低(p0.05)。大體油紅0染色和主動脈根部HE染色示lenti-M2BP組的主動脈AS病變范圍和主動脈根部AS病變面積顯著降低。Lent i-M2BP組的巨噬細胞和脂質成分明顯低于Lenti-nu]]和PBS組,而平滑肌和膠原成分明顯高于Lenti-null和PBS組,易損指數(shù)明顯低于Lenti-null和PBS組。免疫組化和RT-PCR分析顯示:Lenti-M2BP組的黏附分子(ICAM 1)、炎癥因子(IL-6、MCP-1、Lp-PLA2)、基質蛋白酶(MMP9和MMP2)水平和血管新生(CD31、VEGFA、Flt-1)明顯低于 Lenti-null 和 PBS 組。4.2 M2BP炎性調控機制的體外研究Ox-LDL能夠濃度依賴和時間依賴性地上調THP-1細胞內M2BP的表達。多種炎癥因子(ox-LDL 20μg/ml、IL-1β10ng/ml、TNF-α1Ong/ml)可以濃度依賴和時間依賴性地上調THP-1細胞內M2BP的表達并呈現(xiàn)疊加增強效應。同時,它們也可以刺激HUVEC細胞上調M2BP的合成分泌并呈現(xiàn)疊加效應。而重組蛋白rhM2BP又可以濃度依賴和時間依賴性地刺激THP-1細胞分泌多種炎癥因子(IL-6,IL-8,TNF-α,MMP-9,Lp-PLA2),并且重組蛋白rhM2BP可以濃度依賴性地促進HUVEC細胞分泌趨化因子(IL-8和MCP-1)并上調表面黏附分子(ICAM-1、VCAM-1和E-selectin)的表達。另外,rhM2BP刺激可以促進THP-1單核細胞與HUVEC細胞的黏附,還可以促進THP-1細胞的趨化。重組蛋白rhM2BP可以濃度依賴性和時間依賴性地上調THP-1細胞內MMP9和MMP2的表達和活性。并且2ug/ml的rhM2BP刺激THP-1細胞1h即可促使NF-kB p65和MAPK(ERK、P38和JNK)信號通路分子顯著磷酸化激活。而給予NF-kB p65和MAPK通路抑制劑預刺激1h后再給予rhM2BP刺激24h可以顯著下調MMP9和MMP2的表達和活性。結論:(1)M2BP在ACS患者的外周血中高表達并與冠脈復雜病變相關;外周血M2BP的水平對ACS患者的預后有獨立預測價值;M2BP聯(lián)合GRACE評分可以提高其對ACS的預后診斷價值。(2)PBMC是外周血M2BP的重要細胞學來源,ACS患者的PBMC中M2BP的mRNA表達水平明顯升高且對冠脈復雜病變有良好的診斷價值和獨立預測價值。(3)M2BP在不穩(wěn)定頸動脈斑塊和斑塊內的易損位點是高表達的,并且與臨床缺血癥狀顯著相關,提示M2BP參與了頸動脈斑塊去穩(wěn)定性的過程。(4)M2BP受炎癥因子的調控,并可以通過上調單核巨噬細胞內炎癥因子的合成分泌、上調血管內皮細胞表面黏附分子的表達和趨化因子的合成分泌、促進單核細胞的趨化遷移及其與血管內皮細胞的黏附、參與斑塊內的血管新生等機制促進動脈粥樣硬化的發(fā)展和斑塊的去穩(wěn)定性。(5)M2BP通過激活細胞內NF-kB p65和MAPK(P38、ERK和JNK)信號通路上調單核巨噬細胞MMP2和MMP9的表達促進膠原的降解進而促進斑塊的易損性。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R543.5
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
符號說明
前言
第一章 M2BP與斑塊去穩(wěn)定性的臨床相關性研究
    第一部分 M2BP在冠心病患者外周血的表達及其在ACS患者中預后價值研究
        材料
        方法
        結果
        附表
        附圖
    第二部分 M2BP在冠心病患者外周血單個核細胞中的表達及對復雜斑塊的預測價值研究
        材料
        方法
        結果
        附表
        附圖
    第三部分 M2BP在人體頸動脈斑塊中的表達及其與斑塊去穩(wěn)定性的相關研究
        材料
        方法
        結果
        附表
        附圖
    討論
    結論
第二章 M2BP對斑塊形成和穩(wěn)定性的影響及其炎性調控機制的基礎研究
    材料
    方法
    結果
    討論
    結論
    附表
    附圖
總結
參考文獻
致謝
攻讀博士期間發(fā)表的學術論文
學位論文評閱及答辯情況表
英文論著Ⅰ
英文論著Ⅱ

【參考文獻】

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1 Tomohiro Maekawa;Yoshihiro Kamada;Yusuke Ebisutani;Makiko Ueda;Tomoki Hata;Koichi Kawamoto;Shinji Takamatsu;Kayo Mizutani;Mayuka Shimomura;Tomoaki Sobajima;Hironobu Fujii;Kotarosumitomo Nakayama;Kimihiro Nishino;Makoto Yamada;Takashi Kumada;Toshifumi Ito;Hidetoshi Eguchi;Hiroaki Nagano;Eiji Miyoshi;;Serum Mac-2 binding protein is a novel biomarker for chronic pancreatitis[J];World Journal of Gastroenterology;2016年17期

本文編號：2888839