研究背景和目的:紅細胞生成指造血干細胞在造血微環(huán)境中,通過細胞的自我更新、增殖、定向分化和脫核等重要的生物學事件,最終產(chǎn)生成熟紅細胞的過程。由于紅細胞生成紊亂或無效造血而引起的貧血是多種人類血液病重要的臨床表現(xiàn),其中包括骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes,MDSs)。MDSs是造血干祖細胞克隆發(fā)生異常的髓系疾病,主要特征是骨髓造血功能缺陷和髓內(nèi)細胞凋亡。而MDSs患者突變頻率最高的的基因是DNA雙加氧酶2(Ten-Eleven-Translocation 2,TET2),其功能是把5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)轉變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcyosine,5-hmC),從而參與DNA去甲基化過程,影響靶基因轉錄和表達。目前,關于TET2突變MDSs患者的紅系異常的分子機制仍不清楚。本課題組已報道,TET2敲低引起c-Kit和AXL介導的紅系祖細胞的克隆性增殖,從而出現(xiàn)功能異常Marker-CFU-E(M-CFU-E)細胞。我們進一步研究發(fā)現(xiàn)M-CFU-E細胞不僅異常增殖,也發(fā)生大量的凋亡。因此,本研究主要是在體外紅系培養(yǎng)發(fā)育體系以及血液腫瘤細胞系中敲低TET2的表達,以期揭示TET2調(diào)控紅系祖細胞凋亡的分子機制,為TET2突變的MDSs疾病相關的凋亡機制提供新的視角,也為治療MDSs疾病提供新的科學依據(jù)。研究方法:首先,我們選用CD34~+磁珠在臍帶血的單個核細胞中分離純度為95%以上的造血干細胞CD34~+,轉染攜帶TET2-shRNA的慢病毒,采用嘌呤霉素(Puromycin)進行篩選,利用qRT-PCR方法,檢測TET2敲低效率并成功獲得TET2敲低細胞。在體外紅系培養(yǎng)體系中,運用流式細胞技術分選出正常組和TET2敲低組紅系祖細胞之后,通過流式細胞分析技術檢測兩組細胞分化和凋亡,通過甩片觀察其形態(tài)。其次,為明確其相關凋亡分子,我們分選出Luciferase CFU-E和M-CFU-E兩組細胞,進行轉錄組測序(RNA-seq),運用生物信息分析的方法,明確TET2敲低后的差異基因和凋亡相關信號通路;為了驗證其表達差異,運用qRT-PCR和流式細胞技術同時檢測了TET2敲低型細胞中凋亡相關分子(FAS,Fas Cell Surface Death Receptor)的表達。為進一步探討TET2敲低引起FAS上調(diào)的分子機制,我們通過糖基化和限制性內(nèi)切酶的處理方式,檢測并分析FAS啟動子區(qū)關鍵CCGG位點的5-mC和5-hmC的差異性。同時,選用FAS的下游通路中Caspase 3特異性抑制劑(Z-DEVD-FMK)進一步驗證其凋亡通路。不僅如此,我們還分選出健康人與TET2突變的MDSs患者骨髓中的造血干細胞,在體外向紅系定向分化,檢測TET2突變對細胞凋亡和FAS表達的影響。最后,由于TET2突變參與了多種血液腫瘤的發(fā)生,因此,我們在紅白血病細胞系K562中敲低TET2的表達,檢測TET2表達下降對K562細胞增殖及凋亡的影響。同時,在K562細胞中過表達FAS,檢測其對增殖和凋亡的影響。研究結果:為了探究TET2在紅系祖細胞發(fā)育過程中發(fā)揮的功能,我們首先驗證了感染TET2-shRNA的CD34~+細胞的敲低效率,結果顯示,實驗組TET2的表達水平大約是對照組TET2的表達水平的40%。在有效敲低TET2的基礎上,進一步分選出TET2-CFU-E,且在體外紅系發(fā)育培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn)TET2有效敲低后,其分化受阻。為了探究分化受阻的細胞相關的表型,分選出功能異常的細胞(M-CFU-E),繼續(xù)用紅系培養(yǎng)體系培養(yǎng),我們發(fā)現(xiàn)其凋亡顯著增加。其次,為明確其相關凋亡分子,通過RNA-seq測序分析,結果顯示Luciferase CFU-E和M-CFU-E之間有多達400個差異基因,含25個與凋亡相關信號通路相關的基因,其中16個表達上調(diào),有FAS、NCKAP1和TNFRSF10B等,其表達顯著上調(diào)。通過qRT-PCR和流式檢測進一步驗證FAS的表達,結果顯示與Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E細胞FAS表達不變,而M-CFU-E細胞中表達上調(diào)。為了探討TET2敲低引起FAS上調(diào)的機制,我們檢測將上述三組細胞進行FAS啟動子區(qū)關鍵CCGG位點(-305,-251,-136,-90)5-mC和5-hmC檢測,結果顯示,與Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E和M-CFU-E細胞中FAS關鍵CCGG位點的5-mC和5-hmC并沒有發(fā)生改變,因此FAS的表達可能不直接受TET2調(diào)控,TET2和FAS之間還存在其他的靶基因來相互調(diào)控基因的表達。為了進一步探究TET2缺失是否通過調(diào)控FAS下游信號分子Caspase 3引起凋亡,因此,我們選用TET2敲低后分選出的M-CFU-E進行挽救實驗,結果顯示,與Luciferase CFU-E相比,Caspase 3特異性抑制劑(Z-DEVD-FMK)不能回復M-CFU-E細胞的凋亡,這表明TET2敲低后紅系早期祖細胞產(chǎn)生的凋亡并不依賴于Caspase 3凋亡的通路。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)與健康人相比,TET2突變的MDSs患者骨髓細胞的造血干細胞在紅系發(fā)育分化的第11天和13天其凋亡顯著增加,同時,FAS的表達在從11天到17天均上調(diào)。最后,由于高風險性向白血病轉化是MDSs疾病的重要特征,而細胞凋亡在MDSs的發(fā)生和演變的過程中扮演重要角色。為了探討TET2調(diào)控的細胞凋亡在MDSs的演變中的功能,我們首先比較健康人骨髓細胞與血液腫瘤細胞K562中的TET2和FAS的表達水平,結果顯示,TET2在K562細胞中的表達為健康人骨髓細胞的一半,并且FAS在K562細胞中不表達。為進一步明確TET2在K562細胞中的功能,我們首先得到TET2敲低的K562細胞,隨后利用Hemin誘導其向紅系分化,結果顯示,與對照組相比,TET2敲低促進細胞增殖,但不影響細胞凋亡,同時FAS的表達也沒有改變。進一步在K562細胞中過表達FAS,結果顯示,高水平的FAS能夠促進K562細胞的凋亡從而抑制其增殖。這表明,FAS的表達水平可能是TET2突變的MDSs疾病是否發(fā)生演變的重要調(diào)控分子,FAS及其下游信號通路可能作為潛在的藥物靶點治療血液腫瘤。結論:綜上所述,本論文探究了TET2在紅系祖細胞階段的重要功能:TET2敲低產(chǎn)生功能異常的M-CFU-E,其分化受阻、凋亡增加以及死亡受體FAS表達上調(diào)。TET2敲低不引起FAS啟動子區(qū)關鍵位點甲基化和去甲基化的改變,因此,TET2可能間接調(diào)控FAS的表達。TET2敲低誘導的細胞凋亡不依賴Caspase 3通路。與此同時,TET2突變的MDSs患者的骨髓細胞也伴隨大量凋亡,并且FAS的表達顯著上調(diào)。不僅如此,TET2敲低還能促進血液腫瘤細胞系K562增殖,但不影響其凋亡。而過表達FAS卻能促進K562細胞的大量凋亡。因此,FAS的表達水平可能作為TET2突變導致的MDSs疾病能否轉變?yōu)榘籽〉闹匾獦酥�。通過本論文的研究,為TET2突變的MDSs疾病相關的凋亡機制提供新的視角,也為治療MDSs疾病提供新的科學依據(jù)。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R551.3
【部分圖文】：

第一章 引言是 HPCs 中重要的一個分支，具有向巨核系和紅系雙向分化的特性[17]，存在促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）和干細胞因子（Stem cell factor，SCF）條件下，MEPs 能分化形成紅系祖細胞階段（BFU-E 至 CFU-E）[9]，繼而進入終末紅系分化階段（Pro-E 至 Ortho-E），最終形成功能成熟紅細胞。對正常的人機體來說，紅細胞必不可少。由于紅細胞特殊的結構，不但可以維持紅細胞特殊的雙面凹陷圓盤形狀，使其能夠最大限度地攝取 O2，而且也增加了紅細胞膜的柔韌度和變形能力，這也為細胞的穿梭和更好的輸送 O2提供便利及條件。此外，紅細胞中特有一種血紅蛋白，能和肺部與 O2結合形成氧合血紅蛋白，這蛋白是紅細胞載 O2的基礎。此外，在整個發(fā)育的過程中，細胞表面的標記分子也發(fā)生了相應的變化，進一步來區(qū)分各個階段的細胞，為后續(xù)分選出各階段細胞提供依據(jù)（圖 1.1）[18]。

圖 1.2 TET 蛋白家族的結構圖和 DNA 去甲基化的循環(huán)過程。（A）TET 蛋白家族的結構圖及相關的結構域[43]；（B）DNA 去甲基化的循環(huán)過程。DNA 甲基轉移酶（DNMTs）將未經(jīng)修飾的 C 轉化為 5-mC。5-mC 可以轉換回尿嘧啶（U）。經(jīng) TET 介導氧化成 5-hmC、5-fC和 5-caC，然后切除 5-fC 或 5-caC 結合堿基切除修復（活性修飾-活性去除（AM-AR）的過程）或依賴復制稀釋的 5-hmC、5-fC 或 5-caC（活性修飾的過程）[53]。1.2.2 紅系發(fā)育中 TET2 研究進展TET2在造血干細胞中扮演著重要的角色，小鼠和人類的造血細胞中均表達，尤其小鼠的造血干/祖細胞（Hematopoietic stem/progenitors cells，HSPC）中高表達[55]，Tet2 缺失導致小鼠造血功能異常，具有較強的自我更新能力、造血再生能力增強和向髓系細胞優(yōu)先分化的特點[56-58]。2011 年，徐明江等人建立了 Tet2敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨髓細胞 5-hmC 水平顯著降低和 5-mC 水平升高，并且增加了髓系惡性腫瘤發(fā)生前的 LSK（linnegSca1+cKit+）細胞池，其 LSK 細胞具有較強的造血再生能力，細胞分化也發(fā)生了改變。此外，大約 1/3 Tet2-/-和 8% Tet2+/-缺失 的 小鼠 在 2 至 4 月齡 時 ，出 現(xiàn)了 類似 慢 性髓 系白 血 病 （ Chronicmyelomonocytic leukemia，CMML）的表型，這是因為髓系惡性腫瘤比如髓系白

7圖 1.3 MDSs 患者細胞的形態(tài)和 TET2 是 MDSs 疾病的高頻突變基因。（A）MDSs 患者（圖片來源于網(wǎng)絡）；（B）MDSs 細胞形態(tài)（圖片來源于網(wǎng)絡）；（C）AML 細胞形態(tài)（圖片來源于網(wǎng)絡）；（D）MDSs 疾病高頻突變基因[64]。1.2.4 MDSs 與凋亡MDSs 常伴凋亡增強[65]。早年研究表明，和正常人骨髓（NBM）相比，MDSs中 RA/RARS 和 RAEB 中細胞凋亡明顯增加，P<0.0001（圖 1.4A）[66]，和早期祖細胞的凋亡高于正常組（圖 1.4B）[67]。另有報道，與 NBM 相比，MDSs 患者骨髓單個核細胞中 FAS 及其配體 FASL 均表達上調(diào)（圖 1.4C）[68]。目前，MDSs疾病中產(chǎn)生的凋亡是否通過 FAS 下游的信號分子 Caspase 3 起作用，其詳細機制還有待與進一步地探究。
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本文編號：2866577