發(fā)布時間：2020-09-15 08:11

　　 目的糖尿病是一種以慢性血糖升高為特征的代謝性疾病,主要分為1型和2型,其中2型糖尿病尤為常見。糖尿病在全球呈廣泛流行趨勢,中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會的糖尿病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,2017年我國2型糖尿病患者已超過1億,位居世界首位。其中,30歲以上人群中,2型糖尿病患病率達(dá)11.6%。每年有490萬人死于糖尿病,其中約50%人死于心血管并發(fā)癥。糖尿病患者中,不依賴于動脈粥樣硬化、高血壓及其他潛在病理因素發(fā)生的左心室功能障礙性疾病稱為糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)。研究報道認(rèn)為,2型糖尿病患者中,DCM的發(fā)病機(jī)制主要是心肌細(xì)胞自噬功能障礙,而持續(xù)高糖及高脂環(huán)境是引起心肌細(xì)胞自噬功能障礙的主要因素。發(fā)生2型糖尿病時,心肌細(xì)胞在高糖和高脂環(huán)境下,發(fā)生胰島素抵抗,心肌細(xì)胞的能量代謝平衡被打破,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化增強(qiáng),引起細(xì)胞自噬功能障礙,使受損細(xì)胞器及有害的代謝產(chǎn)物無法清除,因而導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,發(fā)生DCM。雖然已經(jīng)明確凋亡在DCM發(fā)生中的作用,但調(diào)控凋亡的具體機(jī)制尚未明確。因此,明確DCM中潛在的凋亡調(diào)控機(jī)制已成為亟待解決的醫(yī)學(xué)問題。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,CREG)是小分子糖蛋白,是重要的心肌保護(hù)因子,可通過多種途徑參與心肌保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室近年研究發(fā)現(xiàn):(1)CREG蛋白在心肌組織中高表達(dá);(2)心肌梗死、血管緊張素Ⅱ或缺血再灌注等病理性損傷可使心肌細(xì)胞中的CREG表達(dá)顯著下調(diào),而補(bǔ)充外源性CREG蛋白則可挽救上述病理因素引起的心肌損傷;(3)更為重要的是,研究還證實(shí)CREG是定位于溶酶體的糖蛋白,可通過調(diào)控溶酶體的發(fā)生和功能從而影響心肌成纖維細(xì)胞自噬功能�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,我們假設(shè)CREG作為心肌細(xì)胞自噬穩(wěn)態(tài)的內(nèi)源性關(guān)鍵調(diào)控基因,可能參與了DCM發(fā)生。然而CREG在DCM中參與凋亡調(diào)控的具體機(jī)制尚未明確。因此,本研究的主要目的是從細(xì)胞學(xué)角度入手,明確CREG調(diào)控高糖高脂刺激下心肌細(xì)胞凋亡的作用及可能機(jī)制。方法(1)采用不同濃度棕櫚酸(0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM),及不同濃度高糖(10mM、15mM、25mM、33mM)刺激大鼠H9C2心肌細(xì)胞,western-blot檢測CREG蛋白表達(dá)水平,確定高糖高脂的最佳刺激濃度。同時,在高糖高脂刺激的不同時間點(diǎn)(12h、24h、36h、48h),檢測CREG蛋白表達(dá)變化,確定高糖高脂的最佳作用時間。(2)為明確高糖高脂作用下CREG與心肌細(xì)胞自噬的相關(guān)性,構(gòu)建CREG過表達(dá)及CREG低表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞模型,并采用高糖高脂刺激24h。Western-blot檢測自噬體蛋白(autophagy marker light chain 3BⅡ,LC3BⅡ)、自噬底物蛋白P62、溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)、凋亡蛋白cleaved-caspase3表達(dá);免疫熒光染色檢測溶酶體酶casthepsinB和casthepsinD表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡比例。(3)為明確CREG是否通過調(diào)控自噬影響心肌細(xì)胞凋亡,分別采用自噬抑制劑氯喹(10mM)及自噬激動劑白藜蘆醇(10mM)對CREG過表達(dá)H9C2心肌細(xì)胞及CREG低表達(dá)H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24h,再給予高糖高脂刺激24h。采用western-blot、免疫熒光染色以及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測CREG蛋白、LC3BⅡ、P62、LAMP1、cathepsinB、cathepsinD及Cleaved-caspase3表達(dá)變化。結(jié)果(1)采用不同濃度棕櫚酸及高糖刺激H9C2心肌細(xì)胞,western-blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)高糖濃度為33mM和棕櫚酸濃度為0.4mM條件下,CREG蛋白表達(dá)明顯減少。因此,確定高糖和棕櫚酸的最佳刺激濃度分別為33mM和0.4mM。此外,在高糖高脂刺激24h后,CREG蛋白顯著降低,并隨刺激時間延長,CREG表達(dá)逐漸下降。(2)H9C2心肌細(xì)胞在高糖(33mM)和高脂(0.4mM)刺激24h后,western-blot檢測發(fā)現(xiàn)CREG蛋白表達(dá)降低,LC3BⅡ和P62表達(dá)增多,LAMP1表達(dá)減少,凋亡蛋白cleaved-caspase3增加。免疫熒光檢測顯示溶酶體酶cathepsinB和cathepsinD減少。同時,流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡明顯增加。以上結(jié)果提示:在高糖高脂刺激下,H9C2心肌細(xì)胞中CREG蛋白表達(dá)減少,溶酶體數(shù)量及功能異常,自噬功能障礙,細(xì)胞凋亡增多。(3)為進(jìn)一步明確CREG在高糖高脂刺激下對心肌細(xì)胞自噬的作用,采用腺病毒CREG及CREG siRNA分別構(gòu)建CREG過表達(dá)(Ad-CREG)及CREG低表達(dá)(CREG-siRNA)的H9C2心肌細(xì)胞。Western-blot檢測CREG表達(dá)變化,結(jié)果證實(shí)CREG過表達(dá)及低表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞模型均成功構(gòu)建。然后,對Ad-CREG組及CREG-siRNA組H9C2心肌細(xì)胞分別進(jìn)行高糖及高脂刺激24h,檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Ad-CREG聯(lián)合經(jīng)高糖高脂刺激24h后,LC3BⅡ、LAMP1表達(dá)較對照組顯著增加,而P62及cleaved-caspase3明顯降低;同還發(fā)現(xiàn)Ad-CREG組中溶酶體酶cathepsinB和cathepsinD表達(dá)增多以及心肌細(xì)胞凋亡比例降低。此外,研究還發(fā)現(xiàn),CRGE-siRNA聯(lián)合高糖高脂刺激后,LC3BⅡ和P62表達(dá)增加,LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表達(dá)減少,心肌細(xì)胞凋亡顯著增加。以上結(jié)果提示:在高糖高脂刺激下,CREG參與H9C2心肌細(xì)胞自噬,并影響其凋亡。(4)為進(jìn)一步明確CREG對高糖高脂刺激下心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控機(jī)制,采用自噬激活劑或抑制劑分別進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):Ad-CREG-HG+PA組經(jīng)氯喹干預(yù)后,CREG蛋白下調(diào),自噬受阻(LC3BⅡ和P62表達(dá)增加,LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表達(dá)降低),細(xì)胞凋亡比例增加。CREG-siRNA-HG+PA組經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后,自噬通路改善(LC3BⅡ表達(dá)增加,P62表達(dá)降低),溶酶體指標(biāo)表達(dá)增加(LAMP1、cathepsinB和cathepsinD表達(dá)增加),細(xì)胞凋亡減少。上述研究結(jié)果證實(shí):在高糖高脂刺激的H9C2心肌細(xì)胞中,CREG可通過調(diào)控溶酶體參與自噬,進(jìn)而影響心肌細(xì)胞凋亡。結(jié)論H9C2心肌細(xì)胞在高糖高脂刺激下,CREG蛋白表達(dá)顯著下降,自噬流障礙,細(xì)胞凋亡增加。過表達(dá)CREG后可改善自噬流障礙及減少細(xì)胞凋亡,而低表達(dá)CREG后自噬障礙及細(xì)胞凋亡加重。通過自噬抑制劑及自噬激活劑干預(yù)后證實(shí),CREG可通過調(diào)控溶酶體參與自噬,進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的凋亡。
【學(xué)位單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.2;R542.2
【部分圖文】：

結(jié) 果（一）不同濃度葡萄糖及棕櫚酸刺激 H9C2 心肌細(xì)胞后 CREG表達(dá)情況采用不同濃度高糖（10mM、15mM、25mM、33mM）刺激 H9C2 心肌細(xì)4h 后，western-blot 檢測 CREG 蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖為 33mM 時，CREG 蛋白表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計意義（P<0.05，圖 1-1）。同濃度棕櫚酸（0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM）刺激 H9C2 心肌細(xì)胞 2發(fā)現(xiàn)，濃度為 0.4mM 時 CREG 蛋白表達(dá)較對照明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)差P<0.05，圖 1-1）；棕櫚酸濃度為 0.6mM 和 0.8mM 時，CREG 蛋白表達(dá)也降為了減少細(xì)胞損傷，選用刺激濃度為 0.4mM。因此，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)將采用 33m萄糖和 0.4mM 棕櫚酸作為高糖高脂的刺激濃度。

高糖高脂刺激 H9C2 心肌細(xì)胞不同時間點(diǎn)后 CREG 蛋高糖高脂刺激H9C2心肌細(xì)胞12h、24h、36h和48h后，應(yīng)用wEG 表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高糖高脂作用 24h 后，H9C2 心肌細(xì)胞降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05，圖 1-2）。在高糖高脂刺激 3EG 蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)，但為了避免心肌細(xì)胞過度損傷，將高定為 24h。

-3 Western-blot檢測高糖高脂刺激H9C2心肌細(xì)胞后CREG及凋亡蛋白注：Con：對照組，Man：高滲對照組，HG+PA：高糖高脂刺激組，*P<0.05 vs.n=3。-4 流式細(xì)胞術(shù)檢測高糖高脂刺激 CREG 過表達(dá) H9C2 心肌細(xì)胞后凋亡注：Con：對照組，Man：高滲對照組，HG+PA：高糖高脂刺激組，*P<0.05 vs.n=3。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Maurizio Salvadori;Giuseppina Rosso;Elisabetta Bertoni;;Update on ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation: Pathogenesis and treatment[J];World Journal of Transplantation;2015年02期

本文編號：2818718