【摘要】：目的:探討miR-96-5p在血小板中對VAMP8的調(diào)控作用及對血小板活化的影響。方法:(1)通過體外培養(yǎng)具有雙向分化潛能的人成巨核細胞白血病細胞Meg-01,采用佛波脂(phorbol-12-mystrate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)其分化成成熟的巨核細胞,進而產(chǎn)生類血小板。(2)通過向分化而成的巨核細胞/血小板內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-96-5p的模擬物(Mimic)及抑制物(Inhibitor),本實驗共設(shè)置五個組:Control組,miR-96-5p Mimic組,Mimic Control組,miR-96-5p Inhibitor組,Inhibitor Control組。用q-RT-PCR檢測各組中miR-96的表達水平、VAMP8 mRNA的表達水平;用Western Blot檢測各組VAMP8、PAC-1、CD62P蛋白表達水平。(3)利用靶基因預(yù)測網(wǎng)址TargetScan預(yù)測VAMP8基因與miR-96-5p是否有結(jié)合位點,并用雙熒光素酶報告基因驗證VAMP8是否是miR-96-5p的靶基因。結(jié)果:(1)Meg-01細胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)72小時后,細胞形態(tài)向成熟巨核細胞形態(tài)變化,且血小板表面標(biāo)記物CD61的表達增加,證實Meg-01細胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)成功分化產(chǎn)生類血小板。(2)向巨核細胞/血小板轉(zhuǎn)染miR-96-5p的模擬物及抑制物后,q-RT-PCR檢測miR-96的表達,miR-96-5p Mimic組的miR-96的表達明顯高于Control組和Mimic Control組(P0.05);miR-96-5p Inhibitor組的miR-96的表達明顯低于Control組和Inhibitor Control組(P0.05)。q-RT-PCR檢測VAMP8 mRNA的表達:miR-96-5p Mimic組對比Control組和Mimic Control組無明顯差異(P0.05);miR-96-5p Inhibitor組對比Control組和Inhibitor Control組無明顯差異(P0.05)。WB檢測miR-96-5p Mimic組的VAMP8、PAC-1、CD62p的蛋白表達明顯低于Control組和Mimic Control組(P0.05);miR-96-5p Inhibitor組的VAMP8、PAC-1、CD62p的蛋白表達明顯高于Control組和Inhibitor Control組(P0.05)。(3)靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-96-5p與VAMP8 3’UTR區(qū)的58-64堿基序列有結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示,共轉(zhuǎn)染了miR-96-5p Mimic和VAMP8 3’UTR WT載體組較共轉(zhuǎn)染了Mimic Control和VAMP8 3’UTR WT載體組熒光強度下降(P0.05);而共轉(zhuǎn)染了miR-96-5p Mimic和VAMP8 3’UTR MUT載體組較共轉(zhuǎn)染了Mimic Control和VAMP8 3’UTR MUT載體組熒光強度無明顯差異,表明miR-96-5p是通過與VAMP8 3’UTR的該結(jié)合位點靶向結(jié)合影響熒光素酶的活性,證實VAMP8是miR-96-5p的靶基因。結(jié)論:(1)miR-96-5p可以在血小板中靶向抑制VAMP8蛋白表達從而抑制血小板活化,miR-96-5p可能成為預(yù)測血小板活化狀態(tài)的指標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果3.1 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo)分化成巨核細胞/血小板Meg-01 細胞為人成巨核細胞白血病細胞，正常的 Meg-01 細胞為圓形的單個懸浮細胞（如圖 3.1.1）。經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72 小時后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，體積增大，細胞呈梭形變化，伸出偽足，細胞核不甚清晰，細胞空泡生成，細胞貼壁增多（如圖 3.1.2）。收集誘導(dǎo)前后的細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞表面 CD61的表達，如圖 3.1.3，誘導(dǎo)后細胞表面 CD61 的表達顯著增加。進一步提取 RNA檢測 CD61 mRNA 的表達，如圖 3.1.4，誘導(dǎo)后細胞 CD61 mRNA 的表達顯著增加。上述結(jié)果表明 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72 小時后成功分化成血小板。

第 3 章 結(jié)果第 3 章 結(jié)果3.1 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo)分化成巨核細胞/血小板Meg-01 細胞為人成巨核細胞白血病細胞，正常的 Meg-01 細胞為圓形的單個懸浮細胞（如圖 3.1.1）。經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72 小時后，細胞形態(tài)發(fā)生變化，體積增大，細胞呈梭形變化，伸出偽足，細胞核不甚清晰，細胞空泡生成，細胞貼壁增多（如圖 3.1.2）。收集誘導(dǎo)前后的細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞表面 CD61的表達，如圖 3.1.3，誘導(dǎo)后細胞表面 CD61 的表達顯著增加。進一步提取 RNA檢測 CD61 mRNA 的表達，如圖 3.1.4，誘導(dǎo)后細胞 CD61 mRNA 的表達顯著增加。上述結(jié)果表明 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72 小時后成功分化成血小板。

細胞呈梭形變化，伸出偽足，細胞核不甚清晰，細胞空泡生成，細胞貼壁增多（如圖 3.1.2）。收集誘導(dǎo)前后的細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞表面 CD61的表達，如圖 3.1.3，誘導(dǎo)后細胞表面 CD61 的表達顯著增加。進一步提取 RNA檢測 CD61 mRNA 的表達，如圖 3.1.4，誘導(dǎo)后細胞 CD61 mRNA 的表達顯著增加。上述結(jié)果表明 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72 小時后成功分化成血小板。圖 3.1.1-3.1.2 Meg-01 細胞經(jīng) PMA 誘導(dǎo) 72h 分化成巨核細胞/血小板

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本文編號：2804233