【摘要】：研究背景及目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是臨床常見疾病,是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。AS是一種主要發(fā)生于大中動脈的慢性炎癥性疾病。由于脂質(zhì)代謝異常,導致血漿脂蛋白濃度升高。在一些理化因素及多種炎癥因子刺激下,血管內(nèi)皮首先發(fā)生破損,進而血漿脂質(zhì)、炎癥因子等成分進入動脈內(nèi)膜并沉積在內(nèi)膜下間隙。由于血管內(nèi)皮受損,血流中的單核細胞易與受損的內(nèi)皮細胞(Endothelial Cell,EC)發(fā)生粘附,并通過內(nèi)皮細胞受損區(qū)域進入內(nèi)皮下。此時,單核細胞攝取內(nèi)皮下沉積的脂質(zhì)而轉(zhuǎn)化成巨噬細胞,而后者又可以通過其細胞膜上的清道夫受體攝入大量脂質(zhì)而形成泡沫細胞。在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中,內(nèi)皮細胞功能失調(diào)是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié),進一步的發(fā)展是血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)受到斑塊局部產(chǎn)生的生長因子、細胞因子以及沉積脂質(zhì)的影響開始增殖,并向內(nèi)膜方向遷移,并逐漸在內(nèi)膜下間隙堆積,形成早期的斑塊。這些泡沫細胞、增殖的平滑肌細胞、沉積的脂質(zhì)等共同構(gòu)成了斑塊中的壞死中心,從而導致動脈粥樣硬化的形成。在斑塊局部產(chǎn)生的大量細胞因子中,血小板衍生因子(Platelet derived growth factor,PDGF)就是其中之一。它的化學趨化性較強,靶細胞主要是血管平滑肌細胞。正常情況下,在血管細胞不表達。當血管受損深達中膜時,其被大量分泌并釋放入血,再與受體結(jié)合形成二聚體,進而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號通路,促進平滑肌細胞的增殖以及由中層向內(nèi)膜層的遷移。PDGF有PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD五種亞型,其中PDGF-BB屬于最強的體外趨化劑。所以本研究以PDGF-BB作為誘導劑。2006年人類基因組計劃完成,大批新基因誕生。2008年國家人類基因組北方研究中心對人類基因組數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析,篩選出許多新基因,人跨膜蛋白98(Transmembrane protein 98,TMEM98)就是其中之一。有研究發(fā)現(xiàn)TMEM98與癌癥、免疫、炎癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而,關(guān)于TMEM98在心血管領(lǐng)域的研究尚未見報道。本課題組前期研究顯示TMEM98不僅在AS小鼠血清及動脈粥樣斑塊組織中高表達,而且可通過IL-8誘導血管平滑肌細胞的增殖和遷移。本研究旨在進一步探討TMEM98在PDGF誘導的血管內(nèi)皮細胞黏附和平滑肌細胞增殖和遷移中的作用及分子機制,為深入研究AS發(fā)病機制提供理論和實驗基礎(chǔ)。實驗方法:(1)運用ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)和實時定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)以及免疫熒光(immunofluorescence)的方法,檢測在PDGF-BB刺激下ECs和VSMCs分泌至培養(yǎng)液中TMEM98的含量以及細胞中TMEM98表達量的變化;(2)設(shè)計并構(gòu)建TMEM98的重組質(zhì)粒和小干擾RNA(Small interference RNA,siTMEM98),分別利用瞬時轉(zhuǎn)染的方法將TMEM98在VSMCs和ECs中進行過表達和敲低(siTMEM98);(3)應用細胞粘附實驗檢測siTMEM98對單核-內(nèi)皮細胞粘附的影響;(4)Boyden Chamber方法檢測TMEM98對VSMCs遷移的影響;(5)用MTT和CCK-8檢測TMEM98對VSMCs細胞增殖的影響;(6)通過免疫熒光技術(shù)分析TMEM98對VSMCs細胞偽足形成的影響;(7)通過qPCR的方法檢測siTMEM98對內(nèi)皮細胞粘附分子ICAM-1(Intercellular adhesion molecule,ICAM-1)和VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule,VCAM-1)表達的影響;(8)運用Western blot法檢測TMEM98對AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號通路以及β-catenin分子的影響。結(jié)果:1.PDGF誘導TMEM98的分泌和表達分別采用PDGF-BB誘導大鼠主動脈平滑肌細胞(Rat aortic smooth muscle cells,A7r5)、人主動脈血管平滑肌細胞(Human aortic smooth muscle cells,AOSMC)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),利用ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液,發(fā)現(xiàn)TMEM98含量明顯升高,且具有時間依賴性。qPCR結(jié)果也顯示上述三種細胞系中TMEM98的表達量明顯升高。免疫熒光結(jié)果顯示PDGF-BB刺激細胞12h,AOSMC和HUVEC中TMEM98的表達量較對照組明顯升高。2.TMEM98調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的粘附及分子機制在PDGF-BB誘導下瞬時轉(zhuǎn)染siTMEM98至HUVEC,下調(diào)TMEM98可以抑制單核-內(nèi)皮細胞粘附,過表達TMEM98可以促進單核-內(nèi)皮細胞粘附。qPCR結(jié)果顯示瞬時轉(zhuǎn)染siTMEM98至HUVEC中,可以明顯抑制粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達。3.TMEM98調(diào)節(jié)平滑肌細胞的增殖和遷移利用MTT和CCK8檢測PDGF-BB誘導的AOSMC和A7r5的增殖,發(fā)現(xiàn)siTMEM98可以明顯抑制細胞的增殖,而TMEM98過表達可以明顯促進其增殖。同樣,利用Boyden Chamber檢測A7r5和AOSMC的遷移能力,發(fā)現(xiàn)siTMEM98可以抑制A7r5和AOSMC的遷移。當外源性TMEM98加入細胞培養(yǎng)液時,研究發(fā)現(xiàn)TMEM98也可誘導AOSMC的增殖及遷移,且具有時間和濃度依賴性。免疫熒光結(jié)果顯示外源性TMEM98可以促進細胞偽足的形成。4.TMEM98通過AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號通路及β-catenin分子調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖和遷移分別利用大鼠原代血管平滑肌細胞、AOSMC和A7r5探尋PDGF誘導的TMEM98對細胞增殖和遷移的分子機制。結(jié)果顯示siTMEM98可抑制A7r5細胞中p-AKT(T308)、p-AKT(S473)和p-GSK-3β的表達。同樣,siTMEM98可抑制PDGF-BB誘導的A7r5細胞中細胞周期蛋白(Cyclin D1)和β-catenin分子的表達。AKT的激動劑(SC79)可以部分恢復siTMEM98下調(diào)的大鼠原代血管平滑肌細胞和AOSMC的增殖以及AOSMC的遷移。SC79可以增加GSK-3β的磷酸化和Cyclin D1的表達。AKT通路的抑制劑(BEZ235)可以抑制AOSMC的增殖及遷移,也可抑制GSK-3β的磷酸化和Cyclin D1的表達。結(jié)論:1.PDGF-BB可誘導TMEM98的分泌和表達,證明TMEM98是一種分泌蛋白;2.TMEM98可通過ICAM-1和VCAM-1的表達調(diào)節(jié)單核細胞與內(nèi)皮細胞的粘附;3.TMEM98促進血管平滑肌細胞的增殖與遷移;4.TMEM98通過調(diào)節(jié)Cyclin D1和β-catenin的表達促進血管平滑肌細胞的增殖與遷移;5.TMEM98通過調(diào)控AKT/GSK-3β/Cyclin D1信號通路促進血管平滑肌細胞增殖和遷移。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5

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本文編號：2803719