【摘要】：目的:血管增生(vascular hyperplasia)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)、高血壓、血管成形術后再狹窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表現。其主要特征表現為血管損傷后,位于血管中膜呈收縮表型的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)出現表型轉化,轉變?yōu)楹铣杀硇?增殖并遷移至內膜從而導致的一種血管重構現象。血小板源生長因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)由血管損傷部位的血小板、內皮細胞、VSMC和炎性細胞分泌產生,與其受體(PDGF receptor-b,PDGFR-β)結合后能夠引起VSMC表型轉化,進而發(fā)揮促細胞增殖和遷移的作用,對于血管重塑和內膜增生的發(fā)生發(fā)展具有明顯的促進作用。內皮和平滑肌細胞來源的neuropilin樣分子(endothelial and smooth muscle cell-derived neuropilin-like molecule,ESDN)是一類I型跨膜蛋白(type-I transmembrane protein),最初是在人類冠狀動脈和高度轉移性肺癌細胞中克隆得到的,其分子內含有一個CUB結構域和一個凝血因子V/VIII同源結構,與Neuropilins結構相似。課題組之前的研究表明,在培養(yǎng)的VSMC中,處于增殖狀態(tài)時ESDN表達顯著高于生長抑制的細胞,而ESDN的過度表達會抑制VSMC生長。在PDGF-BB誘導的VSMC增殖模型中,ESDN敲除及敲低能夠上調PDGF-BB誘導的細胞增殖作用。該結果表明ESDN在調節(jié)血管細胞生長方面起著重要作用,其分子機制可能與ESDN對PDGF-BB及其受體的調控有關,但是,ESDN調控PDGF受體信號途徑影響VSMC增殖和血管增生的機制研究目前尚不清楚。本實驗利用小鼠頸總動脈結扎術誘導血管內膜增生模型以及PDGF-BB誘導VSMC增殖模型,探討ESDN調控PDGF受體信號途徑影響VSMC增殖及其與血管重構的關系。方法:1.平滑肌細胞特異性敲除小鼠的培育和基因型鑒定:利用從耶魯大學醫(yī)學院心血管系Dr.Mehran Sadeghi(Yale University School of Medicine)實驗室引進Esdn~(flox/flox)小鼠和購買的SM22a-Cre小鼠培育平滑肌細胞特異性敲除小鼠。選取6~8周齡大小的小鼠,按雌雄比例為2:1進行交配,繁殖仔鼠,取仔鼠鼠耳組織提取基因組DNA,用聚合酶鏈反應(PCR)技術進行基因型鑒定,成功培育出Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠,同時提取血管組織Western blot驗證其敲除效果。2.小鼠內膜增生模型制備與分組選取8~12周的WT、Esdn~(-/-)小鼠,平滑肌細胞特異性敲除小鼠,雄性,各30只,隨機分為3 d、7 d、14 d、21 d和假手術組,異氟烷吸入式麻醉,體式顯微鏡下行左側頸總動脈結扎術,假手術組只分離血管,不結扎,分別于結扎術后3、7、14、21 d時生理鹽水心臟灌流后取材。將取材的血管分為兩部分,一部分用OCT包埋劑包埋、液氮迅速冷凍、冰凍切片,備用;另一部分用RIPA裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40,0.1%SDS,1 mM EDTA),臨用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich)裂解,提取總蛋白質,Western blot檢測VSMC增殖標志蛋白骨橋蛋白(osteopontin,OPN)以及分化標志基因α-骨骼肌肌動蛋白(smooth musclea-actin,SMa-actin)、平滑肌22a(smooth muscle22 alpha,SM22a)的表達。3.冰凍切片HE染色和免疫熒光染色分析選取結扎不同時間血管組織的冰凍切片(5mm),進行組織HE染色及免疫熒光染色,顯微照相后利用Image J software(National Institutes of Health,USA)觀察內膜增生和中膜變化確定其血管增生狀態(tài);利用熒光顯微鏡觀察Esdn~(-/-)小鼠和野生型小鼠;平滑肌細胞特異性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠各組不同時間點血管組織中ESDN、CD31(內皮細胞標志蛋白)和SMa-actin(VSMC標志蛋白)的陽性熒光強度。4.VSMC培養(yǎng)與siRNA敲低ESDN的表達按照本室報道的貼塊法培養(yǎng)大鼠VSMC,取3-5代細胞進行實驗。將VSMC接種在60mm小皿中,用含20%胎牛血清的無抗生素培養(yǎng)基,在37℃和5%CO_2細胞培養(yǎng)箱中孵育12-24小時后,待細胞生長至60-70%融合時,細胞用20 nM的ESDN siRNA或通用陰性對照(銳博)小干擾RNA轉染,按照Lipofectamine RNAi Max試劑盒操作說明進行。轉染24小時之后根據細胞密度換液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,換成無血清培養(yǎng)基血清饑餓24 h后,分別給予PDGF-BB(10 ng/mL)刺激不同時間(0、5、15、30 min),收集RNA確定轉染效率和蛋白用于Western blot檢測PDGF信號途徑的變化。5.細胞膜蛋白和胞漿蛋白的提取培養(yǎng)的VSMCs,利用siRNA敲低ESDN表達,血清饑餓24 h后,應用PDGF刺激不同時間后,利用Invent公司Minute-~(TM)總膜和質膜提取試劑盒分別提取胞漿和胞膜蛋白,Western blot檢測PDGFR-β在敲低ESDN表達后在細胞各組分中分布的不同。6.細胞表面PDGFR-β的測定為觀察ESDN表達對VSMC表面PDGFR-β動態(tài)變化的影響,培養(yǎng)的大鼠VSMC應用siRNA敲低ESDN的表達后,在PDGF刺激不同時間(0、5、30 min)的培養(yǎng)基中加入生物素(0.15 mg/mL sulfo-NHS-SS-biotin,Pierce,Rockford,IL)對細胞表面蛋白進行共價標記,10 min后應用1×PBS緩沖液(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,2 mM KH_2PO_4,10 mM Na_2HPO_4)清洗并終止反應,加入細胞裂解液(50 mM Tris pH 7.5,150 mM NaCl,0.5%脫氧膽酸鈉,1%NP-40,0.1%SDS,1mM EDTA),臨用前加入complete proteinase inhibitor(Roche Applied Sciences)和phosphatase inhibitor cocktails(Sigma-Aldrich),離心收集上清用于細胞總PDGFR-β的測定;應用鏈合親霉素(Streptavidin-agarose beads,Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)收集生物素標記的蛋白,清洗后上樣Western blot檢測細胞表面PDGFR-β的變化。結果:1.平滑肌細胞特異性Esdn敲除小鼠基因型鑒定對Esdn~(-/-)小鼠;平滑肌細胞特異性敲除小鼠Cre~(+/-)Esdn~(flox/flox)小鼠及其對照Cre~(-/-)Esdn~(flox/flox)小鼠進行基因型鑒定。Esdn~(-/-)小鼠基因型鑒定引物(PCR擴增產物長度為360 bp):上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-AAGCTTAAGTGATGTGACAG-3’Esdn~(flox/flox)小鼠基因型鑒定引物(280bp,野生型為230 bp)上游引物:5’-CAGCCAAACCTCCAGAAAAG-3’下游引物:5’-TCACAAGAGAGAGGGGTGCT-3’SM22 Cre小鼠基因型鑒定引物(陽性對照324 bp,Cre 100 bp)SM22-Cre上游引物:5’-GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC-3’SM22-Cre下游引物:5’-GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT-3’SM22-Cre陽性對照上游引物:5’-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3’SM22-Cre陽性對照下游引物:5’-TAGGTGGAAATTCTAGCATCATC-3’瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在目的區(qū)域呈現清晰的條帶,表明基因型鑒定正確,平滑肌細胞特異性Esdn基因敲除小鼠構建成功。提取不同基因型小鼠血管組織進行Western blot檢測ESDN的表達,在Esdn~(-/-)小鼠血管組織中未檢測到ESDN的表達,而在平滑肌細胞特異性基因敲除小鼠血管組織中ESDN的表達較對照小鼠顯著下降,結果進一步證實了基因型鑒定正確,表明平滑肌細胞特異性基因敲除小鼠構建成功。2.ESDN缺失促進內膜損傷后的血管增生WT、Esdn~(-/-)小鼠結扎不同時間后取材,HE染色結果顯示,隨著結扎時間的延長,與對照組相比,Esdn~(-/-)小鼠血管中膜VSMC排列紊亂,內膜逐漸增厚,管腔狹窄,在結扎21 d時達到高峰。隨后Western Blot檢測平滑肌增殖標志蛋白OPN,平滑肌分化標志蛋白SMa-actin、SM22a的表達情況,結果顯示,與對照組相比,隨著結扎時間的延長,Esdn~(-/-)小鼠血管組織中OPN的表達均逐漸增加,結扎21 d時達到高峰;SMa-actin、SM22a的表達均逐漸降低,結扎21 d時達到最低。應用免疫熒光染色技術進一步觀察ESDN表達對血管中膜SMC增生的影響,結果顯示,在結扎21 d時,ESDN的表達與血管組織中SMC標志物SMa-actin的表達呈現共定位現象,表明ESDN可能通過影響中膜SMC的增殖進而影響血管增生過程。這一結果在平滑肌細胞特異性敲除小鼠得到了進一步的驗證。3.ESDN表達下調促進PDGF的信號途徑為進一步探討ESDN缺失促進血管增生的分子機制,體外培養(yǎng)大鼠VSMC,siRNA敲低ESDN的表達,血清饑餓后,用10 ng/mL的PDGF-BB處理VSMC不同時間后收集蛋白,Western blot檢測PDGF受體磷酸化及其下游信號途徑的變化。結果顯示,與對照組相比,ESDN表達下調促進PDGF誘導的PDGFR-β的磷酸化活化,在PDGF刺激15 min達到峰值。同時對與VSMC遷移和增殖相關的PDGF下游信號分子進行了檢測,Western blot結果顯示,與對照組相比,ESDN表達下調促進PDGF誘導的MAPK-ERK和Akt的磷酸化活化,在PDGF刺激后的5 min和15 min各自達到其峰值。這一結果表明,ESDN表達下調可能通過促進PDGF誘導的PDGFR-β的磷酸化活化,進而激活下游相關信號分子MAPK-ERK和Akt的磷酸化,加速VSMC的遷移和增殖過程,與整體動物實驗得到的結果一致。4.ESDN敲低加速PDGF誘導的PDGFR-β胞吞過程研究表明,PDGF與其相應的受體PDGFR-β結合后引起受體磷酸化活化并經過胞吞作用進入細胞質基質,為確定ESDN表達是否能夠調控PDGF誘導的PDGFR-β胞吞過程,應用生物素標記細胞表面蛋白并用Streptavidin富集并Western blot檢測細胞膜上PDGFR-β的分布,結果表明ESDN敲低后細胞表面的PDGFR-β較對照組顯著減少,表明ESDN表達下調促進PDGF誘導的PDGFR-β胞吞過程;同時提取了膜蛋白、胞漿蛋白檢測了PDGFR-β在細胞不同組分的分布,結果表明與對照組相比,ESDN敲低顯著減少了PDGF刺激后PDGFR-β在細胞膜的分布,而在同一時間點PDGFR-β在細胞胞漿的分布顯著高于對照組。這些結果表明,ESDN表達下調促進PDGF的信號途徑可能是通過增強PDGFR-β胞吞過程相關。結論:1.ESDN缺失小鼠和平滑肌細胞ESDN特異性敲除小鼠血管中膜平滑肌細胞增殖和新生內膜增生增強;2.ESDN表達下調促進血管平滑肌細胞PDGF信號途徑;3.ESDN調控PDGF的信號途徑的分子機制與其對PDGFR-β胞吞過程的調控有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54
【圖文】：

圖 1 小鼠子代基因型鑒定和不同品系小鼠血管組織 ESDN 的表達Fig.1 The identification of the offspring genotypes and ESDN expressionlevels in aortaA：PCR results . 1: WT, 2: Esdn-/-mice, 3: Esdnflox/+mice, 4: Esdnflox/floxmice,5: Cre-/-Esdnflox/floxmice, 6: Cre+/-Esdnflox/floxmice. B: Western blottinganalysis of ESDN expression in aorta from different mice.

29圖 2 野生型和 Esdn-/-小鼠結扎后不同時間點血管增生的變化Fig.2 The vascular hyperplasia in isolated aorta from WT and Esdn-/-mice at different time point after ligationA: HE staining of representative cross-sections of the carotid artery inwild and Esdn-/-mice at different times of ligation. Bar: 200 m. B:Immunofluorescence staining of -actin in ligated carotid arteries ofdifferent ages. Bar: 50 m.

30圖 3 野生型和 Esdn-/-小鼠結扎后不同時間點血管組織中平滑肌細胞表型相關蛋白表達的變化Fig.3 The marker genes of phenotypic switch expression in isolated aorta fromWT and Esdn-/-mice at different time point after ligationCompared with the WT group, the expression of SM -actin and SM22was decreased, while OPN expression was increased in Esdn-/-aorta atdifferent time points after ligation. n=3, *P<0.05 compare with control groupat the same time point.

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本文編號：2798302