【摘要】：研究背景:鈣離子從肌漿網(wǎng)釋放到胞漿中來(lái)起動(dòng)心肌細(xì)胞收縮,當(dāng)鈣離子由鈣泵重吸收到肌漿網(wǎng)時(shí),心肌細(xì)胞由收縮轉(zhuǎn)為舒張。細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)對(duì)維持心肌收縮功能起重要作用。鈣泵活性受多因素影響,如細(xì)胞內(nèi)pH、鈉離子濃度、鈣離子濃度。在生理情況下,Na+/H+交換體(NHE)和Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(NBC1)在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH、鈉離子濃度、鈣離子濃度中發(fā)揮重要作用。既往研究表明,抑制細(xì)胞膜上NHE可通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子蓄積而抑制缺血后心臟重構(gòu)和改善心力衰竭。有研究表明在肥厚和衰竭的心臟中NBC1表達(dá)顯著上調(diào),提示心肌細(xì)胞排H+能力增強(qiáng)。隨著H+從細(xì)胞中大量排出,鈉離子大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起鈉離子超載,然后通過(guò)Na+/Ca2+交換體將鈣離子移入細(xì)胞內(nèi),引起鈣離子超載,而鈉離子超載和鈣離子超載可導(dǎo)致心功能失調(diào)。NBC1在肥厚和心衰的心臟中表達(dá)上調(diào),但其具體作用機(jī)制暫不明確。因此,我們做出假設(shè):心臟特異性過(guò)表達(dá)NBC1通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,降低心肌收縮力,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,加重心臟重構(gòu)。研究?jī)?nèi)容:1.本研究用NBC1轉(zhuǎn)基因小鼠制作心梗模型,通過(guò)檢測(cè)心功能、血流動(dòng)力學(xué)、組織學(xué)等指標(biāo),驗(yàn)證NBC1過(guò)度激活對(duì)心臟重構(gòu)的影響。2.在離體實(shí)驗(yàn)中,分離并培養(yǎng)成年小鼠心肌細(xì)胞,使用腺病毒過(guò)表達(dá)NBC1,在不同條件下檢測(cè)心肌細(xì)胞鈣離子動(dòng)力學(xué),闡明過(guò)表達(dá)NBC1引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,導(dǎo)致細(xì)胞收縮功能下降的機(jī)制。研究方法:研究方法分為在體研究方法(動(dòng)物)和離體研究方法(成年小鼠心肌細(xì)胞)。1.在體研究方法:構(gòu)建NBC1轉(zhuǎn)基因(Tg)小鼠,在Tg和野生型(WT)小鼠上制作心梗模型,觀察過(guò)表達(dá)NBC1對(duì)心梗后6周的心功能、血流動(dòng)力學(xué)、心臟重構(gòu)以及生存率的影響。2.離體研究方法:分離和培養(yǎng)C57BL/6成年小鼠心肌細(xì)胞(AMVMs)。構(gòu)建NBC1過(guò)表達(dá)腺病毒,在AMVMs中過(guò)表達(dá)NBC1。處理因素為過(guò)表達(dá)NBC1、缺氧6小時(shí)、使用NBC1抑制劑S0859。檢測(cè)不同條件下鈣離子動(dòng)力學(xué)及心肌細(xì)胞收縮功能、鈣瞬變等指標(biāo)。研究結(jié)果:1.Tg小鼠心梗后死亡率較WT組顯著增加生存分析結(jié)果提示:心梗后6周,Tg組小鼠死亡率明顯比WT小鼠高。NCB1轉(zhuǎn)基因小鼠的死亡率為77.5%(31/40)明顯高于野生型小鼠的死亡率30%(6/20)。小鼠死亡大多數(shù)發(fā)生在心肌梗死后的第3天至第10天。對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行尸體解剖發(fā)現(xiàn)肺水腫、胸腔積液、血凝塊或心臟左室游離壁穿孔,這些結(jié)果提示心梗后死亡的主要原因是急性心力衰竭或心臟破裂。2.過(guò)表達(dá)NBC1惡化心肌梗死后6周的心功能在心梗6周的小鼠中,相對(duì)于假手術(shù)組,心梗組小鼠的左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末內(nèi)徑(LVESd)、左室松弛時(shí)間常數(shù)(Tau)、心重體重比(HW/BW)及肺重體重比(LW//BW)明顯增加;而左室舒張期前壁厚度(LVAWd)、左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室收縮壓(LVSP)、左室壓力最大上升速率(dp/dt max)、左室壓力最大下降速率(dp/dt min)及收縮指數(shù)明顯降低。心梗6周后相對(duì)于WT,Tg組小鼠dp/dt max、dp/dt min及收縮指數(shù)顯著降低;而Tau明顯升高;其他指標(biāo)無(wú)明顯差異。超聲檢查和左室血流動(dòng)力學(xué)檢查的結(jié)果表明,NBC1過(guò)表達(dá)加重心梗后6周左室功能障礙。3.過(guò)表達(dá)NBC1抑制AMVMs的收縮功能和惡化細(xì)胞鈣離子動(dòng)力學(xué)在AMVMs中,過(guò)表達(dá)NBC1加重缺氧對(duì)肌小節(jié)縮短率和鈣瞬變振幅的抑制;過(guò)表達(dá)NBC1加重缺氧引起的鈣瞬變達(dá)峰時(shí)間(Tpeak)和鈣瞬變衰減時(shí)間常數(shù)(τd)的延長(zhǎng);給予NBC1抑制劑S0859后可以部分減輕過(guò)表達(dá)NBC1和缺氧對(duì)肌小節(jié)的縮短率,鈣瞬變的振幅,Tpeak和Td的影響。4.過(guò)表達(dá)NBC1增加缺氧條件下AMVMs內(nèi)鈉離子和鈣離子的濃度過(guò)表達(dá)NBC1或缺氧均增加AMVMs內(nèi)鈉離子和鈣離子的濃度,過(guò)表達(dá)NBC1進(jìn)一步加重缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子的濃度增加。使用NBC1特異性抑制劑S0859減輕缺氧和過(guò)表達(dá)NBC1引起的細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鈣離子的增加。5.過(guò)表達(dá)NBC1加重缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡過(guò)表達(dá)NBC1明顯增加了心梗后6周交界區(qū)心肌細(xì)胞的凋亡和缺氧誘導(dǎo)的AMVMs凋亡,而這一現(xiàn)象在AMVMs中可以被NBC1特異性抑制劑S0859部分拮抗。研究結(jié)論:過(guò)表達(dá)NBC 1通過(guò)促發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載來(lái)加重小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)。NBC1可能是治療心臟重構(gòu)的潛在靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R542.22
【圖文】：

博士學(xué)位論文逡逑ＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＣ－３＇邐，邐５ＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＡＣＴ－３，。使用雜合的邋ＮＢＣ１邋轉(zhuǎn)基因小鼠（ｎ邋＝邋７它們的野生型（ＷＴ）同窩小鼠（ｎ邋＝邋７５）進(jìn)行分析。獲得了六對(duì)雜合子（），并且使用第７８對(duì)來(lái)繁殖后代，純合子轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠用于后實(shí)驗(yàn)研宄。通過(guò)ＰＣＲ檢測(cè)心臟特異性轉(zhuǎn)基因ＮＢＣ１邋（圖１Ｃ）。逡逑Ａ逡逑

小鼠心肌梗死后６周，分別通過(guò)實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定小鼠心臟逡逑中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，心肌梗死后６逡逑周小鼠心臟中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)表達(dá)都有明顯的升高（圖３－１，圖３－２），逡逑提示ＮＢＣ１可能參與缺血性心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。逡逑木逡逑工勹邐邋《逡逑Ｑ邐■逡逑＾邐３．邐ｒｎｍｍ逡逑ａ逡逑＾邋？逡逑ｉ２－邐丁逡逑＾邋０－１邋￣￣—逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ逡逑圖３－１心肌梗死后６周，實(shí)時(shí)ｑＰＣＲ測(cè)定心臟中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ表達(dá)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ１邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑＰＣＲ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｍｉｃｅ邋６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ逡逑２．0ｉ邐＊逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ邐ｇ邋１．５－逡逑ＮＢＣｌ邐１２１ｋＤ邋＾邋１．０］邐？逡逑ＧＡＰＤｈ｜邐｜邋３７邋ｋＤ邋Ｚ逡逑—．．…－一—邐0．0Ｊ邐＾邐逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ逡逑圖３－２心肌梗死后６周，蛋白質(zhì)印跡測(cè)定心臟ＮＢＣｌ的蛋白質(zhì)表達(dá)。＞＜０．０５，心肌梗逡逑死組ｖｓ．假手術(shù)組。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ邋ｌ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋６逡逑ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋ＭＩ邋ｖｓ．Ｓｈａｍ．逡逑表３－ｌ．ＮＢＣｌ

小鼠心肌梗死后６周，分別通過(guò)實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定小鼠心臟逡逑中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)表達(dá)。結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，心肌梗死后６逡逑周小鼠心臟中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)表達(dá)都有明顯的升高（圖３－１，圖３－２），逡逑提示ＮＢＣ１可能參與缺血性心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。逡逑木逡逑工勹邐邋《逡逑Ｑ邐■逡逑＾邐３．邐ｒｎｍｍ逡逑ａ逡逑＾邋？逡逑ｉ２－邐丁逡逑＾邋０－１邋￣￣—逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ逡逑圖３－１心肌梗死后６周，實(shí)時(shí)ｑＰＣＲ測(cè)定心臟中ＮＢＣ１的ｍＲＮＡ表達(dá)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋ｍＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ１邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅ邋ｑＰＣＲ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｍｉｃｅ邋６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ逡逑２．0ｉ邐＊逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ邐ｇ邋１．５－逡逑ＮＢＣｌ邐１２１ｋＤ邋＾邋１．０］邐？逡逑ＧＡＰＤｈ｜邐｜邋３７邋ｋＤ邋Ｚ逡逑—．．…－一—邐0．0Ｊ邐＾邐逡逑Ｓｈａｍ邐ＭＩ逡逑圖３－２心肌梗死后６周，蛋白質(zhì)印跡測(cè)定心臟ＮＢＣｌ的蛋白質(zhì)表達(dá)。＞＜０．０５，心肌梗逡逑死組ｖｓ．假手術(shù)組。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉａｃ邋ＮＢＣ邋ｌ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｅ邋６逡逑ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ＭＩ．邋＊Ｐ邋＜邋０．０５，邋ＭＩ邋ｖｓ．Ｓｈａｍ．逡逑表３－ｌ．ＮＢＣｌ

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3 郭s

本文編號(hào)：2794005