發(fā)布時間：2020-08-13 01:03

【摘要】：1研究背景動脈粥樣硬化疾病(atherosclerosis,AS)是一種動脈管壁的進展性炎癥疾病,在引起急性心腦血管疾病例如心肌梗死和中風之前可以很多年都沒有臨床癥狀。在AS的發(fā)展過程中,伴隨內(nèi)皮細胞損傷,脂肪和膽固醇逐漸沉積在動脈管壁上,形成AS脂核,在脂核之外,覆蓋著一層由平滑肌細胞(SMC)、成纖維細胞和膠原組織等形成的纖維帽。AS斑塊中還有巨噬細胞、T細胞和中性粒細胞等炎性細胞的浸潤。當纖維帽中的SMC減少、細胞外基質(zhì)合成減少或降解增多時,斑塊纖維帽變薄,導致斑塊不穩(wěn)定和斑塊破裂,引發(fā)急性冠脈事件。因此尋找增加斑塊穩(wěn)定性的方法和藥物具有重要的臨床意義。目前,在干細胞與AS領域的研究表明,間充質(zhì)干細胞(MSC)可以遷移到損傷組織,分化為功能細胞并且修復受損的組織。移植的MSC可以定位到破裂的斑塊區(qū)域,分化成為內(nèi)皮細胞并分泌膠原纖維。此外,骨髓、血液循環(huán)以及動脈外膜中的平滑肌祖細胞都可以分化為SMC并遷移到損傷區(qū)域;在某些條件下,外膜中的胚胎成纖維細胞也可以向內(nèi)膜遷移并分化為SMC。干細胞抗原1(Stem cell antigen 1,Sca1)是外膜平滑肌祖細胞的常見標志物,由于外膜中的Sca1+血管祖細胞和胚胎成纖維細胞更靠近AS的損傷內(nèi)膜并且來源更加廣泛,因此如何有序調(diào)控Sca1細胞和胚胎成纖維細胞向SMC的精準分化變得更加重要。大量研究表明,DKK3對于胚胎組織的生長發(fā)育不可缺少,例如神經(jīng)管上皮、胚芽和骨組織,另外DKK3可以抑制多種類型的細胞腫瘤,過表達時可以抑制細胞的增殖;目前,有研究指出DKK3能夠影響上皮-間充質(zhì)的轉化,促進部分誘導的多能干細胞(partially induced pluripotent stem cell)向平滑肌細胞分化。因此DKK3可能是一種合適的干細胞誘導因子,深入研究DKK3誘導調(diào)控外膜Sca1+血管祖細胞和胚胎成纖維細胞向SMC分化影響斑塊穩(wěn)定性的機制具有十分重要的臨床意義。2研究目的我們的研究目的包括:(1)研究DKK3對于胚胎成纖維細胞和Sca1+細胞誘導分化的促進作用及其分子機制;(2)研究兩種分化而來的SMC對于DKK3-/-ApoE-/-小鼠串聯(lián)狹窄手術引起的動脈粥樣硬化病變的作用,探討DKK3對于AS斑塊炎癥、平滑肌細胞數(shù)量以及細胞外基質(zhì)含量的影響;(3)研究DKK3對于家兔動脈粥樣硬化斑塊的影響;(4)在臨床患者中研究DKK3與動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關系。3研究方法1.小鼠串聯(lián)狹窄病變模型將 8 周齡 DKK3-/-/ApoE-/-和 DKK3+/+/ApoE-/-小鼠(C57BL/6J 背景)高脂喂養(yǎng)6周然后進行手術。麻醉后分離右側頸總動脈,分別在距離頸動脈分叉處1mm的遠端和距離遠端狹窄3mm的近端制作一個外徑為150μm的串聯(lián)狹窄。繼續(xù)飼養(yǎng)4周造成動脈粥樣硬化模型。2.血管外膜細胞孵育將總量為1×106來源于GFP轉基因小鼠的Sca-1+祖細胞與25μL的Matrigel(?)基底膜混合,然后接種于接受串聯(lián)狹窄手術小鼠的頸動脈外膜中。4周后取材進行后續(xù)實驗。3.DKK3凝膠釋放實驗在DKK3釋放實驗中,將重組的DKK3(200ng/mL)與30%的Pluronic 127凝膠混合,然后外敷于接受串聯(lián)狹窄手術的小鼠的頸動脈外膜上將血管包住。4周后取材進行后續(xù)實驗。4.靜脈移植實驗選取3月齡DKK3-/-/ApoE-/-和DKK3+/+/ApoE-/-小鼠,麻醉后將右側頸總動脈游離,切去一段動脈,取一段同窩異體小鼠的腔靜脈用8.0絲線與兩個動脈斷端吻合。觀察到移植靜脈有搏動證明移植成功。5.股動脈損傷和細胞孵育實驗DKK3+/+/APoE-/-小鼠麻醉后分離雙側股動脈,來回插入0.25mm導絲三次造成動脈損傷,長度為從股動脈到遠端肌肉分支4mm。右側損傷股動脈外膜注入25μL的Matrigel?人工基底膜,其中包含源自SM22-Lacz小鼠的Sca-1+細胞和胚胎成纖維細胞(1×106),另一端作為對照,72小時后取材。6.體內(nèi)基質(zhì)膠栓實驗在嚴重免疫缺陷小鼠背部和腰間皮下注射50μL混有HUVECs的基質(zhì)膠,實驗組膠內(nèi)加入標記有Qtracker?605的胚胎成纖維細胞分化的SMC,對照組膠內(nèi)加入未誘導的胚胎成纖維細胞。每組小鼠各選擇六個注射點。12天后處死小鼠并將栓子取出,一部分迅速投入液氮,進行后續(xù)的冰凍切片實驗;另一部分用4%福爾馬林溶液浸泡過夜后進行組織學染色。7.組織學染色石蠟切片或冰凍切片用HE染色觀察形態(tài),免疫組織化學染色檢查RAM-11、α-SMA、MMP-9,免疫熒光檢測 SM22、SMMHC、SMA、CD68,Collal、DKK3、elastin、CD31、CD144、Calponin、Sca1,天狼猩紅染色檢查彈力纖維和膠原。8.β-半乳糖苷酶原位染色取5mm經(jīng)過損傷手術的股動脈,剝?nèi)ブ窘M織和血管外膜后沿長軸縱切,用β-半乳糖苷酶染色固定液固定組織,加入染色工作液,37℃孵育直至部分細胞顏色變藍。然后在普通光學顯微鏡下觀察、拍照。9.細胞培養(yǎng)人類胚胎成纖維細胞購自ATCC,用F-12K培養(yǎng)基(ATCC,30-2004)培養(yǎng)。每兩天更換一次培養(yǎng)基,每三天按照1:3或者1:7的比例傳代。小鼠Sca-1+祖細胞和胚胎成纖維細胞分離自不同小鼠的主動脈內(nèi)膜,包括ApoE-/-小鼠、野生型小鼠以及轉基因小鼠(GFP-Sca-1;SM22-LacZ),然后用抗Sca-1磁珠試劑盒純化細胞。純化后細胞用含10%的EmbryoMax?內(nèi)皮細胞級的高品質(zhì)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入10ng/ml的白血病抑制因子和0.1mM的2-巰基乙醇,培養(yǎng)皿同樣預先包被0.4%的明膠。分離Sca-1+細胞后,剩余細胞用胚胎成纖維細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),傳代5次后即為純化的胚胎成纖維細胞。10.細胞轉染和藥物刺激人類胚胎成纖維細胞和Sca1+細胞加入過表達腺病毒,24小時后換液,繼續(xù)加入指定藥物刺激,培養(yǎng)至指定時間收取細胞;人類胚胎成纖維細胞和Sca1+細胞加入沉默慢病毒和polybrene,24小時后換液,繼續(xù)加入指定藥物刺激,培養(yǎng)至指定時間收取細胞。11.胚胎成纖維細胞核轉染ATF6用NHDF核轉染試劑盒對人胚胎成纖維細胞進行電穿孔轉染ATF6轉錄因子質(zhì)粒,對照組用PCMV5空載體。將2×106個細胞和2μg的空載體或ATF6質(zhì)粒共培養(yǎng),然后接種于包被明膠的培養(yǎng)板上,在DM培養(yǎng)基中分化48小時,收集細胞進行Q-PCR實驗。12.RNA提取、反轉錄和Q-PCR按照說明書用RNA提取試劑盒提取總RNA,用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,然后進行Q-PCR。13.免疫印跡將20-50μg總蛋白與1×的SDS上樣緩沖液煮沸10分鐘,根據(jù)蛋白分子量的不同選擇4%-12%的Bis-Tris膠,然后用90V電壓電泳分離蛋白,200mA電流轉膜2小時將膠上蛋白轉至PVDF膜上,然后用TBST配制的5%牛奶室溫下封閉1小時,用相應一抗孵育過夜。第二天用相應辣根過氧化物酶標記的二抗孵育PVDF膜,室溫下孵育2小時,然后用ECL化學發(fā)光法檢測蛋白。14.細胞免疫熒光細胞首先用4%多聚甲醛固定,然后在室溫下用5%豬血清封閉30分鐘。用相應一抗孵育過夜。第二天用相應的熒光二抗37℃下孵育30分鐘,用DAPI染核,用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。15.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清或培養(yǎng)基按照說明書進行稀釋后按照步驟進行操作,檢測血清和培養(yǎng)基中DKK3濃度,培養(yǎng)基中的膠原1a1和TGFβ1的濃度。16.熒光素酶活性分析在進行胚胎成纖維細胞實驗時,預先在12孔板中包被明膠,轉染DKK3過表達病毒,24小時后用myocardin或SMMHC啟動子報告載體轉染細胞,對照組加入pGL3-Luc-Renilla。轉染48小時后用多功能酶標儀檢測熒光素酶和光素酶活性。相對熒光素酶單位(Relative Luciferase Unit,RLU)定義為熒光素酶與光素酶的比值,空白對照組設置為1.0。17.家兔實驗20只體重在1.5-2.0 kg,年齡在8-10周的新西蘭大白兔隨機分為2組,每組10只。首先耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉家兔,利多卡因局部麻醉后暴露右側股動脈,用小剪刀剪一個小口,插入針鞘,將導絲從針鞘插入直到胸主動脈,取一個4-Fr球囊導管(3.5×15 mm2)沿導絲進入股動脈,進入足夠深度后用肝素鹽水充盈球囊,加壓至8個大氣壓力,然后將球囊導管回抽至腹主動脈分叉處,釋放球囊內(nèi)壓力并再次插入到胸主動脈處,反復進入回抽三次造成動脈內(nèi)膜損傷。術后家兔繼續(xù)用含1%膽固醇和3%豬油的飼料喂養(yǎng)12周。從第12周開始,每兩周通過耳緣靜脈注射一次腺病毒,病毒量為2.5×109pfu,實驗組注射DKK3過表達病毒,對照組注射相同量的腺病毒空載體,從第13周開始,每兩周耳中動脈取血一次,第20周處死家兔,取整段主動脈進行后續(xù)實驗。18.主動脈油紅O染色分離整段主動脈,剝離血管外膜和脂肪組織,縱切,暴露血管內(nèi)膜,拍照后用油紅O染液浸泡2-4小時然后用70%酒精脫色直到僅內(nèi)膜中的脂肪組織著色。然后用蒸餾水沖洗,置于4%福爾馬林溶液中保存。將染色后的整段血管展開后拍照分析。19.血脂檢測小鼠處死時心臟取血0.5-1.0mL,室溫下靜置1小時直至血液凝結,然后以2000 g/min的速度離心15分鐘。家兔造模后分別在第12、13、14、15、17、20周取血,用全自動生化分析儀檢測血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)的含量。20.臨床患者檢測收集山東大學齊魯醫(yī)院從2015年6月至2015年]2月的病例,根據(jù)患者的病史和臨床癥狀按照Braunwald分類法分為穩(wěn)定性心絞痛組和不穩(wěn)定性心絞痛組。記錄入組患者的一般臨床指標,包括身高、體重、年齡、性別、血壓、血糖、每日吸煙和飲酒量。入組患者在用藥前進行一次靜脈采血,化驗室檢測其血清中白細胞、肌酐、纖維蛋白原、同型半胱氨酸、空腹血糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,用ELISA試劑盒檢測血清中DKK3含量。4研究結果1.DKK3敲除改變動脈粥樣硬化斑塊成分利用串聯(lián)狹窄手術構建小鼠動脈粥樣硬化模型,4周后進行HE染色可見DKK3-/-ApoE—/-雙敲小鼠斑塊內(nèi)出血多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,而斑塊中SMC含量和細胞外基質(zhì)含量少于DKK3+/+ApoE-_-小鼠,巨噬細胞浸潤多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,天狼猩紅染色顯示DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠彈力纖維和膠原表達減少。2.DKK敲除增加移植血管破裂發(fā)生率構建小鼠頸動脈移植模型,在DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠組,十只小鼠全部發(fā)生了移植血管破裂并發(fā)癥,可見破裂、壞死、鈣化和紅細胞聚集,而DKK3+/+ApoE-/-小鼠組僅有2只發(fā)生移植血管破裂并發(fā)癥。檢測斑塊內(nèi)成分發(fā)現(xiàn)DKK3-/-ApoE-/-雙敲小鼠斑塊內(nèi)SMC減少而CD68+巨噬細胞增多,而彈力纖維和膠原含量減少。3.DKK3促進Sca1+細胞遷移對小鼠進行串聯(lián)狹窄手術,取帶有GFP標記的轉基因小鼠的原代Sca1+細胞,注射到手術后的頸動脈外膜中,結果發(fā)現(xiàn)Sca1+細胞在4周內(nèi)遷移到DKK3+/+ApoE-/-小鼠內(nèi)膜,并部分分化為SMC,而Sca1+細胞在DKK3-_-ApoE-_-雙敲小鼠血管外膜中的遷移能力降低。此外,Sca1+細胞減少了 DKK3+/+ApoE-_-小鼠斑塊內(nèi)出血的發(fā)生率。4.Sca1+細胞和胚胎成纖維細胞促進內(nèi)膜損傷修復對DKK3+/+ApoE-/-小鼠進行股動脈損傷手術,將來自SM22-Lacz小鼠和野生型小鼠的Sca1+細胞和胚胎成纖維細胞注射至其血管外膜,3天后可見細胞遷移至內(nèi)膜并分化為SMC。5.DKK3在體外可以誘導胚胎成纖維細胞分化為SMCDKK3可以促進胚胎成纖維細胞在DM分化培養(yǎng)基中的分化,4天后形態(tài)上即逐漸向SMC轉化,在基因水平和蛋白水平上都表達SMC的特異分子,并且可見SMMHC和myocadin的啟動子活性明顯增加。6.DKK3誘導胚胎成纖維細胞向SMC的分化受TGF-β1調(diào)節(jié)在DKK3過表達和僅有空載體處理的胚胎成纖維細胞中添加人的重組TGF-β]因子。結果同時添加DKK3過表達病毒和TGF-β1重組蛋白的胚胎成纖維細胞形態(tài)與未處理的胚胎成纖維細胞和僅添加TGF-β1因子的成纖維細胞明顯不同,前者形態(tài)更趨向于平滑肌。PCR和免疫印跡顯示TGF-β]刺激可以進一步增加過表達DKK3的胚胎成纖維細胞表達SMC特異分子和細胞外基質(zhì)。在DKK3過表達的胚胎成纖維細胞中添加TGF-β1受體ALK5的特異性抑制劑,結果顯示,ALK5受抑制后,SMC特異蛋白的表達顯著下降。同樣,向培養(yǎng)基中添加抑制活化TGF-β1的特異性中和抗體也可以抑制SMC標志物的表達。向添加TGF-β1細胞因子的胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)基中加入含或不含DKK3沉默(shDKK3)的慢病毒。結果顯示,DKK3沉默后,SMC特異蛋白和細胞外基質(zhì)明顯減少。用慢病毒外源性沉默TGF-β1的表達也可以減少SMC特異蛋白和細胞外基質(zhì)的分泌,這表明SMC的分化進程受到了抑制。7.DKK3通過激活ATF6調(diào)節(jié)TGF-β1的表達通過Qiagen Champion芯片轉錄因子搜索發(fā)現(xiàn)當DKK3過表達時轉錄激活因子6(ATF6)上調(diào)。為了驗證DKK3是否能夠誘導ATF6的表達,我們對胚胎成纖維細胞感染了 shDKK3或者空病毒載體,結果發(fā)現(xiàn)DKK3沉默時,ATF6表達也下降,同時,用小干擾RNA沉默ATF6也可以導致TGF-β1在基因水平和蛋白水平的減少,相反ATF6過表達則不僅可以增加TGF-β1的表達還能增加SMC各種特異蛋白和細胞外基質(zhì)的表達。8.DKK3誘導胚胎成纖維細胞分化為有功能的SMC我們還采用基質(zhì)膠栓注射的實驗來研究誘導的SMC與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)混合時在體內(nèi)形成功能血管的能力。DKK3誘導的SMC添加了紅色追蹤標簽然后在人工基底膜中與HUVEC混合,混合后注入重癥綜合性免疫缺陷(SCID)小鼠皮下。兩周后收取標本并進行HE染色。結果顯示這些細胞可以形成完整的血管。冰凍切片免疫熒光染色檢測內(nèi)皮細胞標志物,結果顯示內(nèi)皮細胞形成了組成血管內(nèi)襯的管狀結構,而誘導分化的SMC正確定位到了外層,包裹住內(nèi)層的內(nèi)皮小管,形成了兩層堅固的血管層。因此我們推斷由DKK3誘導分化而來的平滑肌具有形成體內(nèi)完整血管的功能。9.DKK3促進Sca1+祖細胞分化為SMCSca1+細胞接種于預先鋪有膠原IV基質(zhì)的培養(yǎng)皿中并且用DM分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。PCR和免疫印跡結果顯示SMC特異蛋白和DKK3表達量都上升。ELISA檢測細胞培養(yǎng)基顯示Sca1+細胞向SMC的分化過程中DKK3表達量升高。免疫熒光染色顯示SMC的特異蛋白和DKK3表達都增多。用shDKK3沉默DKK3可以看到SMC特異蛋白減少,用DKK3抗體中和分泌型DKK3也可以得到相同結果。用重組DKK3蛋白或者過表達DKK3刺激細胞進行研究,結果表明SMC特異蛋白增多。10.DKK3通過調(diào)節(jié)Wnt通路促進Sca1+祖細胞分化用DKK3的抗體中和了 Sca1+細胞培養(yǎng)基中的DKK3因子,可以看到Wnt通路的靶基因下調(diào),用shDKK3沉默DKK3也可以得到相似的結果。我們用反轉錄實時定量PCR分析器分析小鼠的Wnt通路。當DKK3過表達時,大部分與Wnt通路相關的基因表達明顯增加;相反,加入shDKK3時,大部分Wnt通路基因表達下降。用Wnt通路的特異性抑制劑可以發(fā)現(xiàn)Wnt通路受到抑制后Sca1+細胞分化過程中SMC特異蛋白表達減少。免疫印跡分析表明過表達DKK3導致小鼠Sca1+細胞中活化狀態(tài)的β-catenin增加,然而用特異性抑制劑抑制Wnt通路后,即使過表達DKK3,SMC標志物也會減少。綜上所述,DKK3可以通過激活Wnt通路使Sca1+細胞分化為SMC。11.外源性DKK3可以減輕DKK3-/-ApoE-/小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成對DKK3-/-ApoE-/-小鼠進行串聯(lián)狹窄手術,然后在其頸動脈外膜敷上含有200μg/ml重組DKK3的pluronic凝膠。對照組采用DKK3+/+ApoE-_-小鼠,其頸動脈外膜測的pluronic凝膠中含有200μg/ml的小鼠血清蛋白。手術4周后取材切片進行HE染色。結果顯示,凝膠中DKK3蛋白的釋放能夠極大減少DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑塊中的紅細胞數(shù)量。免疫熒光染色結果顯示凝膠釋放DKK3可以增加DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑塊中SMC的含量,減少CD68巨噬細胞的浸潤,與DKK3+/+ApoE-/-小鼠沒有明顯差異。天狼猩紅染色顯示兩組小鼠的細胞外基質(zhì)含量也沒有明顯差異。因此這些結果表明外源性給予DKK3同樣能夠減少斑塊內(nèi)出血和巨噬細胞浸潤、增加SMC和細胞外基質(zhì)含量,從而改變斑塊成分。12.DKK3過表達可以改變家兔動脈粥樣硬化斑塊的成分通過球囊拉傷加高脂喂養(yǎng)的方法構建家兔晚期動脈粥樣硬化斑塊模型。喂養(yǎng)10周后,通過耳緣靜脈注射腺病毒的方法使家兔過表達DKK3。血清ELISA檢測顯示注射后DKK3持續(xù)升高。免疫組化檢測結果顯示DKK3腺病毒注射組斑塊中SMC含量明顯高于空載體注射組,而巨噬細胞浸潤明顯少于空載體注射組,而且MMP9+細胞少于空載體注射組。天狼猩紅染色結果顯示DKK3腺病毒注射組ECM含量高于空載體注射組。油紅O染色結果顯示兩組斑塊大小沒有明顯差別。13.不穩(wěn)定心絞痛患者血清中DKK3含量降低分別收集穩(wěn)定性心絞痛患者和不穩(wěn)定性心絞痛患者血清。用ELISA的方法檢測其血清中DKK3含量,結果顯示不穩(wěn)定性心絞痛患者血清DKK3水平降低。5研究結論1.我們首次證明了 DKK3是一種強有力的SMC分化誘導因子,在胚胎成纖維細胞中,DKK3可能通過與某種受體結合來激活ATF6進而激活TGF-β1,導致胚胎成纖維細胞分化為平滑肌細胞。2.在Sca1+血管祖細胞中,DKK3通過間接結合到Wnt結合位點ATF6,然后激活Wnt/β-catenin通路導致Sca1+血管祖細胞分化為平滑肌細胞。3.DKK3通過其誘導分化功能增加小鼠和家兔動脈粥樣硬化易損斑塊內(nèi)平滑肌細胞和膠原纖維、彈力纖維含量,減少巨噬細胞浸潤和斑塊內(nèi)出血的發(fā)生率,具有重要的治療作用。4.不穩(wěn)定心絞痛患者血清DKK3濃度下降,提示DKK3可能可以作為分子標志物預測不穩(wěn)定心絞痛的發(fā)生。1.研究背景心肌纖維化是指心臟組織中膠原異常增殖、不同類型的膠原構成比例失調(diào)、排列紊亂。任何能夠增加心臟后負荷以及影響神經(jīng)-體液的因素都可能導致心臟肥大和心肌纖維化,表現(xiàn)為室壁僵硬、收縮能力和灌注下降。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活是導致心肌纖維化的最重要原因。血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)AngⅡ是RAAS系統(tǒng)中最重要的組分,可以直接影響心肌細胞和成纖維細胞,導致心肌細胞肥大和成纖維細胞增殖、過度分泌細胞外基質(zhì)。因此,阻斷AngⅡ的生物學效應必將對損傷的心肌產(chǎn)生保護作用。研究發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)可以裂解血管緊張素Ⅱ并且形成血管緊張素1-7(Ang1-7),后者對于心肌肥厚和纖維化具有一定的保護作用,顯示出ACE2潛在的治療價值。同時,近年研究發(fā)現(xiàn),金屬蛋白酶 17(A disintegrin and metalloproteinase 17,AD AM1 7)具有降解 ACE2的功能,因此我們推測其可能與血管緊張素Ⅱ導致的心肌損傷存在相關性。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt通路的核心效應分子,當其在細胞質(zhì)中增多時引起細胞核轉位增多,進而引起促心肌肥厚和纖維化相關基因轉錄增多,導致心肌纖維化和心肌肥厚。糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一種抗心肌肥厚激酶,游離狀態(tài)的GSK-3β可以被招募到卷曲蛋白受體(Frizzled receptor)上,從而與β-catenin結合,促進β-catenin的降解,阻斷其核轉錄。轉化生長因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)的生物學功能非常廣泛,主要包括誘導內(nèi)皮細胞合成功能、促進成纖維細胞合成膠原、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性等。在心肌纖維化的過程中,TGF-β1不僅調(diào)節(jié)各種信號轉導途徑,還可以直接刺激CF細胞增殖,是導致心肌纖維化最重要的調(diào)節(jié)因子。因此,在本實驗中我們檢測了 TGF-β1在AngⅡ誘導的心肌纖維化中的作用。目前,已有研究報道dickkopf-3(DKK3)對于心肌具有一定保護作用,而其在AngⅡ誘導的心肌纖維化中的作用尚不清楚,對心肌組織中GSK-3β/β-catenin信號通路和ADAM17/ACE2的表達變化也沒有研究,對此我們進行了本次研究。此外我們還研究了 DKK3是否影響TGF-β1/Smad3信號通路進而調(diào)節(jié)AngⅡ的致纖維化作用。2.研究目的本研究的目的主要有四個:(1)研究DKK3過表達是否減輕AngⅡ誘導的心肌肥厚和纖維化;(2)在AngⅡ誘導的心肌纖維化小鼠模型中,研究DKK3是否能夠影響GSK-3β/β-catenin信號通路;(3)研究DKK3與ADAM17/ACE2和TGF-β1信號通路的關系;(4)研究DKK3對AngⅡ誘導的炎癥和成纖維細胞增殖的作用。3.研究方法1.小鼠原代心臟成纖維細胞培養(yǎng)無菌條件下取新生C57BL/6小鼠的心臟,在培養(yǎng)基中剪碎后用Ⅱ型膠原酶消化三小時。離心后用完全培養(yǎng)基重懸沉淀,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2小時后換液去除未貼壁雜質(zhì),然后繼續(xù)培養(yǎng)純化成纖維細胞以備后續(xù)實驗。2.細胞轉染和藥物刺激過表達實驗首先將DKK3過表達病毒或者空載體按MOI=100加入成纖維細胞中,24小時后換液,加入1μg/ml的血管緊張素Ⅱ,共培養(yǎng)48小時后進行后續(xù)實驗。分組如下:OV+AngⅡ組:DKK3過表達病毒+血管緊張素Ⅱ;AD+AngⅡ組:空載體病毒+血管緊張素Ⅱ;AngⅡ組:僅加血管緊張素Ⅱ;OV組:僅加DKK3過表達病毒;AD組:僅加空載體病毒;NC組:空白對照。3.細胞抑制實驗原代心臟成纖維細胞接種后生長至30%然后進行刺激。將DKK3的小干擾RNA及對照RNA與載體混合后加入培養(yǎng)基,4小時后換液,24小時后加入1μg/ml的血管緊張素Ⅱ,再培養(yǎng)48小時,提取蛋白進行下一步實驗。共分為四組:組1(NC-siRNA):僅添加陰性小干擾RNA;組2(NC-siRNA+Angll):加入陰性小干擾 RNA 和 AngⅡ;組 3(DKK3-siRNA+Angll):加入 DKK3 小干擾 RNA 和 AngⅡ;組 4(DKK3-siRNA):僅加入 DKK3 小干擾 RNA。4.動物實驗取60只10到12周齡的野生型C57BL/6小鼠,隨機分為4組,用微量泵以1000 ng/kg/min的速度緩慢泵入血管緊張素Ⅱ或生理鹽水,持續(xù)28天,埋泵前三天尾靜脈注射DKK3過表達腺病毒或空白病毒載體(2×109pfu),在第15天注射第二次病毒,第31天測量血壓并處死小鼠。動物實驗分組如下:組1(OV+AngⅡ):注射DKK3過表達病毒+泵入血管緊張素Ⅱ;組2(AD+Angll):注射空病毒載體+泵入血管緊張素Ⅱ;組3(OV):注射DKK3過表達病毒+泵生理鹽水;組4(AD):注射空病毒載體+泵生理鹽水。5.實時定量RT-PCR使用TRlzol試劑提取小鼠左心室的總RNA,然后用PCR熱循環(huán)儀進行實時定量PCR,檢測心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和β肌球蛋白重鏈(beta-myosin heavy chain,β-MHC)。具體參數(shù)為 95℃ 運行 30 s 然后 95℃ 運行 5 s共40個循環(huán),最后56℃運行10 s。GAPDH用作內(nèi)參,實驗結果采用2△△CT進行計算。6.免疫印跡(Western blot)分析使用相應的蛋白提取試劑盒提取小鼠左心室或原代心肌成纖維細胞的總蛋白和核蛋白。各組調(diào)整相同蛋白上樣量,電泳分離不同分子量蛋白,然后轉至PVDF膜上。4℃條件下孵育相應的抗體過夜。所用一抗包括兔抗DKK3抗體、兔抗膠原Ⅰ、膠原Ⅲ抗體,兔抗磷酸化ADAM 17(T735)抗體,兔抗ACE2抗體、兔抗TGF-β1抗體、兔抗ADAM17抗體、兔抗GSK-3β抗體、兔抗磷酸化GSK-3β(Ser9)抗體、兔抗 β-catenin 抗體,兔抗活化 β-catenin(Ser33/37/Thr41)抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、兔抗Smad3、磷酸化Smad3(Ser423/425)抗體以及小鼠抗β-actin抗體,第二天孵育相應二抗后用化學發(fā)光法檢測蛋白表達。7.細胞增殖分析(EDU)采用EDU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)染色的方法檢測細胞增殖。在染色前進行細胞爬片并加入相應的藥物刺激,然后加入含F(xiàn)BS和EDU的染料,多聚甲醛固定后用Triton X-100進行細胞通透,加入甘氨酸中和多聚甲醛;用Apollo-Fluor覆蓋細胞并在室溫下避光孵育、Hoechst33342染色后避光拍照,統(tǒng)計陽性細胞的百分比。8.免疫熒光CFs細胞用4%多聚甲醛固定后用山羊血清封閉,用Triton X-100進行細胞通透,加入兔抗active-β-catenin抗體覆蓋細胞,4℃孵育過夜。第二天加入抗兔熒光二抗,避光孵育后DAPl染核,熒光顯微鏡拍照并計數(shù)分析。9.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)小鼠血清DKK3濃度、Ang(1-7)、炎癥因子白介素1β(IL-]β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的濃度用ELISA試劑盒檢測。操作步驟均按照試劑盒說明書進行,重復三次取平均值。10.小鼠心功能及病理學檢測小鼠處死前(第31天)用小動物超聲儀進行心功能的檢測。在第3天和第31天尾靜脈測量小鼠血壓。處死前測量小鼠體重和脛骨長度,處死后進行心臟灌洗,然后吸干水分稱量心臟重量,計算心重比(HW/BW)及心脛骨比(HW/TL)。取下心臟后進行大體標本拍照比較。11.組織病理學和免疫組織化學小鼠心臟取下后浸泡在4%多聚甲醛中,24小時后流水沖洗過夜,在心尖部中下1/3的位置進行石蠟包埋。然后切片,厚度為5μm。進行HE、Masson染色。免疫組織化學所用一抗為兔抗ACE2、兔抗膠原Ⅰ、膠原Ⅲ,兔抗CD45、CD68以及兔抗IL-6,二抗為北京中山金橋公司生產(chǎn)試劑盒,按照說明書進行操作,應用Image-Pro Plus 6.0進行數(shù)據(jù)分析。4.研究結果泵入血管緊張素后,尾靜脈注射DKK3過表達病毒的小鼠比僅注射生理鹽水的小鼠心臟肥大和間質(zhì)纖維化水平明顯減輕,而且心肌肥大相關指標ANP和β-MHC明顯減少;纖維化相關指標膠原Ⅰ和膠原Ⅲ明顯減少,心肌炎癥反應降低;在體外實驗中,DKK3過表達還可以減少心肌成纖維細胞的增殖和炎癥反應,抑制磷酸化GSK-3β表達,減少β-catenin核轉錄;另外DKK3過表達可以降低磷酸化的ADAM]7的表達,進而增加ACE2的表達,促進血管緊張素Ⅱ的降解,增加Ang(1-7)的含量;當敲減DKK3時,磷酸化ADAM17表達增多,導致ACE2表達下降。同時,DKK3過表達還可以抑制AngⅡ誘導的TGF-β1信號通路激活,DKK3敲減可以增強TGF-β1信號通路。5.研究結論DKK3過表達能夠抑制血管緊張素Ⅱ引起的心肌肥厚和纖維化,其機制與抑制GSK-3β和β-catenin,并且減少β-catenin核轉錄有關;另外DKK3過表達可以降低磷酸化的ADAM17的表達,進而增加ACE2的表達,促進AngⅡ的降解,增加Ang(1-7)的含量;同時,DKK3還可以抑制AngⅡ誘導的TGF-β1信號通路激活。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5;R542.23
【圖文】：

圖１丨）ＫＫ３（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）敲除加重ＡＳ病變進展，提高斑塊內(nèi)出血發(fā)生率逡逑串聯(lián)狹窄手術后四周不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊

圖２邋ＤＫＫ３敲除減少ＡＳ斑塊中ＳＭＣ含量逡逑小鼠頸動脈串聯(lián)狹窄手術后４周取材進行免疫熒光染色。逡逑（Ａ，Ｂ）免疫熒光染色檢測斑塊中ＳＭＡ邋（平滑肌肌動蛋白）的含量。（Ｃ）陽性逡逑細胞的統(tǒng)計圖（結果用均數(shù)±標準誤表示，ｎ＝１０，邋＊Ｐ＜０．０５）。逡逑

邋ＤＫＫ３敲除增加ＡＳ斑塊內(nèi)巨噬細胞浸潤，減少ＥＣＭ但對斑塊大小無影響逡逑小鼠頸動脈串聯(lián)狹窄手術后４周取材進行免疫熒光染色和天狼猩紅染色并逡逑其斑塊面積。逡逑（Ａ．邋Ｂ）免疫熒光染色檢測兩組小鼠頸動脈斑塊中ＣＤ６８含量，Ｂ圖左卜＇角插逡逑

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 陳文強,張運,張梅,季曉平,殷樂,朱永鋒;Establishing an animal model of unstable atherosclerotic plaques[J];Chinese Medical Journal;2004年09期

本文編號：2791281