【摘要】：LKB1通過Hippo-Yap信號在心肌細(xì)胞增殖中的作用研究研究背景:在全世界范圍內(nèi),隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高,心肌梗死的發(fā)病率和死亡率不斷上升。心肌梗死的發(fā)生通常是指冠狀動脈的血流急劇減少或者中斷而導(dǎo)致的心肌缺血性壞死。心梗發(fā)生之后,大量心肌細(xì)胞死亡,纖維瘢痕形成,心功能明顯受損。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為心臟是一種終末分化器官,成年哺乳動物心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期循環(huán),失去了增殖的能力。近年來的研究發(fā)現(xiàn),心臟是不斷更新的器官,人類心肌細(xì)胞的更新率隨年齡的增大而逐漸降低,在20歲時(shí)心肌細(xì)胞的年更新率為1%,到75歲時(shí)降至0.3%。但是心肌細(xì)胞這種微弱的增殖能力并不足以彌補(bǔ)心肌梗死后死亡的細(xì)胞。研究表明,以小鼠為例,小鼠的心肌細(xì)胞在出生后一周以內(nèi)增殖能力明顯下降,到出生后三周,增殖能力在正常情況下幾乎完全消失。如何更大程度地促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖用以補(bǔ)充死亡的心肌細(xì)胞是現(xiàn)階段心肌再生研究的重點(diǎn)。肝臟激酶B1(LKB1)作為一種絲/蘇氨酸激酶被廣泛研究,它在細(xì)胞極性、細(xì)胞增殖和腫瘤抑制中發(fā)揮著重要的作用。我們發(fā)現(xiàn)LKB1的表達(dá)與小鼠出生后心肌細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)。出生后第一天LKB1表達(dá)量較低,隨著心肌細(xì)胞增殖能力的降低,LKB1表達(dá)量逐漸升高。因此,我們推測當(dāng)抑制LKB1的表達(dá)時(shí),心肌細(xì)胞的增殖能力提高。而我們的前期研究剛好證明了,在心肌細(xì)胞中,當(dāng)LKB1表達(dá)降低時(shí),心肌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。但是LKB1如何參與并調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖,目前尚不十分清楚。研究顯示,Hippo-YAP信號通路是參與心肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵信號,YAP作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞周期的調(diào)控。細(xì)胞周期的調(diào)控是一個(gè)涉及多種信號的分子的復(fù)雜過程,然而,YAP是否參與LKB1降低對心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控,目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此,本研究提出LKB1降低通過YAP信號調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的假設(shè),通過體外建立LKB1 siRNA處理模型和成年小鼠心梗的AAV9感染模型,檢測LKB1降低時(shí)對心肌細(xì)胞增殖能力的影響,并通過對YAP和Cyclin D的檢測和調(diào)控,明確LKB1降低調(diào)控心肌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。研究方法:1.以C57/BL6小鼠為研究對象,通過提取小鼠不同時(shí)間點(diǎn)(出生后1,7,28天)的心臟RNA,比較心臟中LKB1的表達(dá)。明確隨著時(shí)間的推移心肌細(xì)胞增殖能力的降低,心臟中LKB1的表達(dá)變化。2.以新生乳鼠的心肌細(xì)胞為研究對象,通過LKB1 siRNA干擾處理,觀察心肌細(xì)胞中LKB1表達(dá)降低,心肌細(xì)胞增殖能力的變化。通過免疫熒光染色的方法,以心肌細(xì)胞核中Ki67,pH3為衡量指標(biāo),計(jì)算心肌細(xì)胞的Ki67,pH3的陽性率,比較LKB1降低之后Ki67,pH3陽性率的變化。明確LKB1降低對心肌細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用。3.以C57/BL6小鼠為研究對象,通過結(jié)扎小鼠心臟左前降支血管建立小鼠心梗模型,通過AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒心包注射到小鼠心臟,觀察小鼠心臟中心肌細(xì)胞Edu的陽性率,明確LKB1降低能夠促進(jìn)成年小鼠心肌細(xì)胞的增殖。4.通過WB實(shí)驗(yàn)檢查在LKB1降低的條件下心肌細(xì)胞中YAP和Cyclin D的變化情況。明確在LKB1降低的條件下,YAP對心肌細(xì)胞增殖具有調(diào)控作用。結(jié)果:1.隨著小鼠出生之后心肌細(xì)胞增殖能力的下降,心臟中LKB1的表達(dá)增加:通過提取心臟組織中的總RNA,比較不同時(shí)間點(diǎn)(出生后1天,7天,28天)心臟中LKB1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)的時(shí)候(出生后1天),心肌細(xì)胞中LKB1的表達(dá)最低,出生后7天,28天心臟中LKB1的表達(dá)均明顯高于出生后1天。2.通過LKB1 siRNA干擾的方法降低心肌細(xì)胞中LKB1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞的增殖指標(biāo)Ki67,pH3均明顯升高:提取新生乳鼠心肌細(xì)胞之后使用LKB1 siRNA處理之后,通過免疫熒光的方式比較心肌細(xì)胞核中Ki67,pH3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)降低可以促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。3.構(gòu)建AAV9-LKB1-GFP-shRNA病毒載體,建立成年小鼠心梗模型,發(fā)現(xiàn)在小鼠心梗之后注射病毒可以提高心肌細(xì)胞增殖能力:在小鼠心梗模型建立之后,心包注射病毒,兩周之后檢查Edu的心肌細(xì)胞陽性率,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞增殖增加。4.WB結(jié)果顯示,LKB1 siRNA處理顯著提高心肌細(xì)胞中YAP和Cyclin D的表達(dá),同時(shí)降低YAP的磷酸化活性。提示我們在LKB1表達(dá)降低時(shí),YAP參與了心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控。結(jié)論:LKB1降低后,心肌細(xì)胞YAP活性升高,通過下調(diào)YAP的磷酸化水平,引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D表達(dá)升高,最后心肌細(xì)胞增殖能力增加。該結(jié)論進(jìn)一步豐富了我們對心肌細(xì)胞增殖能力調(diào)控的理論知識,為心梗病人的心肌細(xì)胞損害的治療提供了新的靶點(diǎn)。鳶尾素對心肌梗死的保護(hù)作用研究研究背景:在全世界范圍內(nèi),心肌梗死的發(fā)病率和死亡率日益增高。冠狀動脈的血流急劇減少或者中斷而導(dǎo)致的心肌缺血性壞死會造成大量心肌細(xì)胞死亡,纖維瘢痕生成,心功能明顯受損。而鳶尾素作為一種在運(yùn)動過程中由骨骼肌分泌的一種蛋白,對多種器官的損傷具有保護(hù)作用。在我們之前的研究中發(fā)展鳶尾素對心肌的缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用,我們猜想,鳶尾素可能同樣會對心肌梗死有保護(hù)作用。研究方法:1.首先為了明確鳶尾素對心肌梗死的作用,我們建立了小鼠的心肌梗死模型,外源性給予鳶尾素(5ug/g/d),腹腔注射給藥連續(xù)兩周,分別在心肌梗死后7天,14天,28天的時(shí)候觀察小鼠的心功能,同時(shí)在心梗后28天檢測心肌的纖維化程度。2.然后為了觀察鳶尾素對心肌細(xì)胞凋亡和血管新生的影響,我們利用Tunel染色的方法比較心肌梗死2天后心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)目,同時(shí)用免疫熒光染色觀察心梗后14天梗死區(qū)域血管新生的情況。3.最后為了明確鳶尾素對血管新生的影響,我們以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對象,分別用鳶尾素和U0126處理,通過Westernblot觀察其對ERK的影響變化,同時(shí)通過細(xì)胞體外遷移能力測定觀察HUVEC的遷移情況。研究結(jié)果:1.在心肌梗死之后,外源性給予鳶尾素處理之后,在心梗后7天,14天,28天對小鼠心功能檢測發(fā)現(xiàn),鳶尾素處理之后在心梗后28天小鼠心功能明顯提高,同時(shí)在心梗后28天發(fā)現(xiàn)小鼠的心肌纖維化程度降低。2.在心梗后兩天Tunel染色發(fā)現(xiàn),鳶尾素給藥的小鼠,心肌細(xì)胞Tunel染色陽性明顯降低,提示心肌細(xì)胞凋亡減少,同時(shí)通過CD31免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),心梗后14天,鳶尾素給藥小鼠,心肌梗死邊緣區(qū)CD31表達(dá)增加,提示有新生血管形成。3.Westernblot的結(jié)果提示我們鳶尾素可以促進(jìn)ERK的磷酸化但是這種促進(jìn)作用可以被U0126阻斷。同時(shí)細(xì)胞遷移能力測定提示我們鳶尾素處理之后,內(nèi)皮細(xì)胞遷移明顯增加,而在同時(shí)應(yīng)用U0126之后,可以減少內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。結(jié)論:鳶尾素通過減少心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌纖維化程度以及促進(jìn)血管新生對心肌梗死發(fā)揮治療作用,并且鳶尾素促進(jìn)新生血管的形成是通過ERK信號介導(dǎo)的。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22
【圖文】：
陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2 在新生乳鼠心肌細(xì)胞當(dāng)中，LKB1 表達(dá)降低促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，一組為對照組（+scramble siRNA 組），一組為實(shí)驗(yàn)組（+LKB1 siRNA 組），干擾處理 48 小時(shí)之后，提取細(xì)胞 RNA，通過熒光定量 PCR 檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中 LKB1 的表達(dá)明顯降低(圖 3-2 A)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，新生乳鼠心肌細(xì)胞中 LKB1 表達(dá)降低之后，免疫熒光染色提示心肌細(xì)胞 Ki67(圖 3-2B)(標(biāo)尺=50μm), pH3(圖 3-2C)(標(biāo)尺=50μm)的陽性率明顯增加（n=5; *P<0.05）。
圖 3-3：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒促進(jìn)成年小鼠心肌細(xì)胞增殖A：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒的對 LKB1 表達(dá)的影響, p＜0.05，n=3;B：AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒對心肌細(xì)胞的感染，GFP 代表 AAV9 病毒，紅色代表 cTnT心肌細(xì)胞；C：MI 后用 AAV9-LKB1-GFP-shRNA 病毒處理對心肌細(xì)胞 Edu 陽性率的影響，B1 為免疫熒光圖片，B2 為統(tǒng)計(jì)圖，箭頭表示 Edu 陽性的心肌細(xì)胞。3.4. LKB1 降低促進(jìn) YAP 介導(dǎo)的 Cyclin D 的表達(dá)原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，其中一組為對照組（scramble siRNA 組），另一組為實(shí)驗(yàn)組（LKB1 siRNA 組）。干擾處理 48 小時(shí)后，分別提取總蛋白，WB 檢測發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中 YAP 表達(dá)明顯升高，同時(shí) YAP 的磷酸化減少（圖 3-4 A），而細(xì)胞周期蛋白 Cyclin D 表達(dá)上升（圖 3-4 B）。（n=6; *P<0.05）。
26圖 3-4：LKB1 表達(dá)降低對心肌細(xì)胞 YAP 和 Cyclin D 的影響A: WB 結(jié)果表示 LKB1 siRNA 處理之后，YAP(A2)和 YAP 磷酸化(A3)的變化，n=6; P<0.05B: WB 結(jié)果表示 LKB1 siRNA 處理之后，Cyclin D 的變化，n=6; P<0.05
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本文編號：
2785839
