發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 17:16

【摘要】：研究目的骨髓異常增生綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病,特點(diǎn)為無(wú)效造血、難治性血細(xì)胞減少,高危MDS會(huì)向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化。目前常根據(jù)國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)(IPSS)來(lái)預(yù)測(cè)MDS向白血病轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn),將MDS分為較低危(多為RCUD,RCMD)和較高危(多為RAEB)狀態(tài)。伴有原始細(xì)胞增多的高�；颊�,向白血病轉(zhuǎn)化的發(fā)生率高,常規(guī)化療效果差,緩解期短,易發(fā)生耐藥,一直是臨床面臨的難題。阿糖胞苷(Ara-C)作為嘧啶類抗代謝藥物,通過(guò)抑制細(xì)胞DNA的合成,干擾細(xì)胞的增殖,是治療高危MDS病人的傳統(tǒng)藥物。然而,MDS病人對(duì)阿糖胞苷的單藥治療的總反應(yīng)率只有20%-30%。有文獻(xiàn)報(bào)道,NRF2與急性髓系白血病(AML),慢性髓系白血病(CML)和慢性淋系白血病(CLL)耐藥有關(guān)。在化學(xué)/氧化應(yīng)激條件下,細(xì)胞中NRF2可逃離KEAP1的抑制,通過(guò)NRF2上Neh1域的一個(gè)核轉(zhuǎn)位信號(hào)進(jìn)入胞核,啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。NRF2的靶基因有:醌氧化還原酶-1(NQO1),血紅素加氧酶(HO-1)和谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCL)等等。以上NRF2的靶基因能夠保護(hù)細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種有毒物質(zhì)引起的應(yīng)激。目前仍未知NRF2是否能提示MDS患者的臨床預(yù)后,或者NRF2是否與MDS患者耐藥相關(guān)。研究方法1)對(duì)已發(fā)表的MDS患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因富集分析,并在MDS患者骨髓標(biāo)本中進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn),以探究MDS患者NRF2的表達(dá)情況,以及其對(duì)預(yù)后的影響。免疫組化染色評(píng)分采用積分半定量法。2)體外實(shí)驗(yàn)以高危MDS細(xì)胞株SKM-1以及MDS小鼠模型細(xì)胞株Ml1PTD/WT/RUNX1-S291fs為主要研究對(duì)象,研究NRF2在MDS中的耐藥作用。利用慢病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建NRF2以及DUSP1 shRNA的細(xì)胞株,并利用Western blot和Q-PCR驗(yàn)證敲低是否成功;利用MTS、臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)檢測(cè)MDS細(xì)胞活性和增殖情況,描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和存活率曲線;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期;通過(guò)尾靜脈注射NRF2 shRNA和scramble shRNA SKM-1細(xì)胞至NOD/SCID-IL2Rynull-SGM3(NSGS)小鼠,構(gòu)建MDS移植小鼠模型,進(jìn)行后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及Q-PCR驗(yàn)證NRF2及DUSP1的關(guān)系。研究結(jié)果1)NRF2在高危MDS中表達(dá)升高,并與不良預(yù)后相關(guān)183例MDS患者的基因富集分析結(jié)果提示:與較低危MDS(RARS和RA)患者相關(guān),NRF2下游靶基因在較高危MDS患者(REAB-1/2)中顯著富集(P=0.020)。137例MDS患者的骨髓免疫組化結(jié)果提示,高危的MDS患者(IPSS-R評(píng)分為極高危、高危和中危)骨髓中NRF2的表達(dá)高于低�；颊�(IPSS-R評(píng)分為低危)(P=0.010)。預(yù)后生存分析結(jié)果顯示,NRF2表達(dá)水平較高的患者(IHC評(píng)分為4～6)總生存期(OS)比NRF2表達(dá)水平較低的患者(IHC評(píng)分為0～3)較短(中位生存期,391 天比 554 天,P=0.011)。2)敲低NRF2使MDS細(xì)胞系對(duì)阿糖胞苷的敏感性增加NRF2抑制劑木犀草素(Luteolin)與阿糖胞苷同時(shí)處理MDS細(xì)胞后可降低阿糖胞苷的IC50。而NRF2激動(dòng)劑萊菔硫烷(Sulforaphane)可使MDS細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷耐藥。NRF2shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染MDS細(xì)胞可顯著降低細(xì)胞NRF2的表達(dá)水平。較高濃度阿糖胞苷處理時(shí),NRF2 shRNA細(xì)胞的早期和晚期凋亡較scramble shRNA細(xì)胞顯著增加,同時(shí)更傾向于S期阻滯。3)NRF2通過(guò)其下游靶基因DUSP1調(diào)節(jié)MDS細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷的耐藥我們分析了公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)里的對(duì)阿糖胞苷敏感(IC506 μM)和耐藥(IC5080μM)的AML病人(共10例)的基因表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)有37個(gè)NRF2下游靶基因既在高危MDS病人中過(guò)表達(dá),也在阿糖胞苷耐藥的AML病人中過(guò)表達(dá)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)及q-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證DUSP1是NRF2的下游靶基因。DUSP1的抑制劑BCI與阿糖胞苷在MDS細(xì)胞中有協(xié)同抑制作用。DUSP1的敲低能夠逆轉(zhuǎn)高NRF2引起的阿糖胞苷耐藥。以上結(jié)果提示,NRF2下游靶基因DUSP1是MDS細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷耐藥的機(jī)制之一。在骨髓移植小鼠中,NRF2敲低的MDS小鼠肝臟腫瘤顯著減小(PBS處理組,2.30 g;阿糖胞苷處理組,1.77 g;P=0.010),DUSP1敲低的MDS小鼠肝臟腫瘤亦顯著減小(PBS處理組,1.84 g;阿糖胞苷處理組,1.41 g;P=0.001)。而在對(duì)照組小鼠中,肝臟腫瘤有減小的趨勢(shì),但無(wú)顯著性差異(PBS處理組,1.91g;阿糖胞苷處理組,1.53g;P=0.052)。研究結(jié)論本文較系統(tǒng)地討論了 NRF2對(duì)MDS細(xì)胞阿糖胞苷耐藥的影響,并對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。研究表明,NRF2表達(dá)水平在高危MDS患者中升高,并且提示不良預(yù)后。高NRF2表達(dá)水平的患者預(yù)后更差。NRF2抑制劑能使MDS細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷反應(yīng)性增加,而NRF2激動(dòng)劑使其對(duì)阿糖胞苷耐藥。NRF2可通過(guò)下游基因DUSP1在MDS中調(diào)節(jié)耐藥作用。本研究顯示,敲低NRF2使MDS細(xì)胞對(duì)阿糖胞苷敏感;NRF2-DUSP1靶向治療與傳統(tǒng)化療的結(jié)合為將來(lái)高危MDS的治療帶來(lái)新希望。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R551.3
【圖文】：

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐正文實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４．１邋ＮＲＦ２在高危ＭＤＳ患者中高表達(dá)逡逑為了觀察ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中的表達(dá)情況，我們?cè)冢保常防停模踊颊吆停保袄龑?duì)照逡逑的骨髓標(biāo)本進(jìn)行ＮＲＦ２的免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中表達(dá)增高逡逑（Ｐ＜０．０５，如圖４．１．１和圖４．１．２所示）�？ǚ綑z驗(yàn)提示中危，高危及極高危組的ＭＤＳ逡逑患者的ＮＲＦ２水平顯著高于低危組的ＭＤＳ患者（（Ｐ＝０．００４，ｘ２＝邋８．１６３，如表４．１．１所示）逡逑

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文邐正文實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑４．１邋ＮＲＦ２在高危ＭＤＳ患者中高表達(dá)逡逑為了觀察ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中的表達(dá)情況，我們?cè)冢保常防停模踊颊吆停保袄龑?duì)照逡逑的骨髓標(biāo)本進(jìn)行ＮＲＦ２的免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示ＮＲＦ２在ＭＤＳ患者中表達(dá)增高逡逑（Ｐ＜０．０５，如圖４．１．１和圖４．１．２所示）�？ǚ綑z驗(yàn)提示中危，高危及極高危組的ＭＤＳ逡逑患者的ＮＲＦ２水平顯著高于低危組的ＭＤＳ患者（（Ｐ＝０．００４，ｘ２＝邋８．１６３，如表４．１．１所示）逡逑

表４．１．１不同ＩＰＳＳ－Ｒ組別的ＭＤＳ患者ＮＲＦ２表達(dá)水平的情況逡逑ＮＲＴ２免疫組化評(píng)￣￣ＮＲＦ２免疫組化評(píng)邋ｆ邐分為０－１邐分為２－６逡逑危組邐１２邐１７邐８Ｊ６３￣０００、高、極高危組邐１８邐９０逡逑利用公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，我們分析了邋１８３名ＭＤＳ患者和１７例健康對(duì)照的ＣＤ３４＋的胞。根據(jù)ＷＨＯ分型，所分析的ＭＤＳ患者分為ＲＡ（ｎ＝５５），ＲＡＲＳ（ｎ＝４８）ＡＢｌ（ｎ＝３７），ＲＥＡＢ２（ｎ＝４３）四類。基因富集分析結(jié)果提示：與健康對(duì)照相ＲＦ２下游靶基因在ＭＤＳ患者中無(wú)顯著性差異（圖４．１．３）。但與低危ＭＤＳ（ＲＡ／ＲＡＲＳ）相比，ＮＲＦ２下游靶基因在高危ＭＤＳ患者（ＲＥＡＢ１／２）中明顯富集．１．４）。逡逑

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