【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)發(fā)病率正在逐漸增高,研究AS及其相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和防治方法成為熱點(diǎn)。二氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)是5α-還原酶還原睪酮雙鍵形成的甾醇,是最具活性的雄激素。既往研究發(fā)現(xiàn),生理水平的DHT可以顯著減少巨噬細(xì)胞中血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor 1,LOX-1)的mRNA的表達(dá),而且至少部分是通過(guò)雄激素受體(androgen receptor,AR)發(fā)揮作用的。為進(jìn)一步探討雄激素及其受體對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的作用,本課題小組前期通過(guò)酵母雙雜交篩選出在男性外周血單核細(xì)胞內(nèi)與AR相互作用的蛋白,得到核糖體蛋白L10(RPL10),前B細(xì)胞白血病同源框蛋白作用蛋白1(PBXIP1),但通過(guò)酵母雙雜交并不能充分證實(shí)蛋白與蛋白間的作用,存在假陽(yáng)性的可能。為此,本實(shí)驗(yàn)旨在利用pull down技術(shù)在體外對(duì)AR與上述蛋白的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證,進(jìn)而探討在男性單核細(xì)胞中的蛋白與AR的相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路,可能作為輔助調(diào)節(jié)因子與AR之間存在相互作用,為動(dòng)脈粥樣硬化致病機(jī)制及治療方向提供理論依據(jù)和靶點(diǎn)。研究方法:本研究采用基因克隆的技術(shù),將pGADT_7-RPL10、pGADT_7-PBXIP1作為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段。將RPL10、PBXIP1基因片段,克隆到利用Eco R I和Bam H I兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切后的含有GST標(biāo)簽的pGEX_4T_2載體上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX_4T_2-RPL10與pGEX_4T_2-PBXIP1,進(jìn)行測(cè)序并分析。利用誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)含有GST標(biāo)簽的蛋白R(shí)PL10與PBXIP1,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,考馬斯亮藍(lán)染膠,脫色觀察蛋白表達(dá)情況。利用pull down技術(shù),將pGBKT_7-AR重組質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯,作為捕獲蛋白;提取在大腸桿菌中表達(dá)的RPL10與PBXIP1蛋白,作為誘餌蛋白,將其固相化到MagneGST~TMM Particles上,將兩種蛋白共同孵育,洗脫,純化,利用Western blot技術(shù)分析相互作用的蛋白復(fù)合物,化學(xué)發(fā)光法鑒定結(jié)果并分析。結(jié)果:通過(guò)PCR技術(shù)獲得目的基因片段,并重組質(zhì)粒GST-RPL10、GST-PBXIP1構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)RPL10、PBXIP1融合蛋白成功表達(dá)后,用pull down和Western blot技術(shù)證實(shí),GST-RPL10融合蛋白大小約在50KD左右,GST-PBXIP1融合蛋白大小約在52KD左右,空白對(duì)照GST蛋白大小約在26KD左右,AR-LBD融合蛋白大小約在37KD左右;兩種蛋白共同孵育后分別用不同抗體檢測(cè)可見GST-RPL10/PBXIP1融合蛋白在體外可以特異性的將c-myc-AR-LBD融合蛋白pull down下來(lái),空白對(duì)照GST蛋白不能將c-myc-AR融合蛋白pull down下來(lái)。結(jié)論:通過(guò)Pull down技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)AR編碼蛋白分別與RPL10、PBXIP1在體外發(fā)生相互作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R543.5
【圖文】：

20）將EP管放入磁力架中，行磁力捕獲，小心移除上清液，加入Magne GSTT結(jié)合/洗滌緩沖液 800ul，上下輕輕顛倒混勻。21）重復(fù) 20）步驟，一共進(jìn)行 3 次洗滌。2、Western Blot 實(shí)驗(yàn)步驟1）利用 SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒配制 12%分離膠和 5%濃縮膠。2）誘餌蛋白和捕獲蛋白復(fù)合體沉淀加入 1×SDS 上樣緩沖液 40ul，在 10pGBKT7- AR-LBD 捕獲蛋白、10ul 誘餌蛋白中，各加入 2×SDS 上樣緩沖液 10u混合均勻，放入水浴鍋中，煮沸 5min。14000g，5min，4℃離心。3）在加樣孔中分別加入捕獲蛋白、共同孵育后的蛋白、誘餌蛋白等，進(jìn)行電泳至染色帶達(dá)邊緣，設(shè)置電壓：濃縮膠為 75V、分離膠為 130V。4）取出凝膠，量好尺寸，準(zhǔn)備好大小相當(dāng)?shù)?PVDF 膜、濾紙，將 PVDF 膜在甲醇中浸濕 5min，按照“陰極-海綿-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿-陽(yáng)極”，按下面的排序排好（圖 1）。

圖 2 目的片段 PCR 結(jié)果A:代表 RPL10 片段,條帶 1 大小與預(yù)期一致,測(cè)序分析,擴(kuò)增成功,B:代表 PBXIP1 片段,條帶 2 為 PBXIP1 片段;大小與預(yù)期一致,測(cè)序分析,擴(kuò)增成功3.1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建利用限制性內(nèi)切酶 EcoR I 和 BamH I，對(duì)載體 pGEX4T2進(jìn)行雙酶切，構(gòu)建含有 GST 標(biāo)簽的重組質(zhì)粒 pGEX4T2-RPL10 、pGEX4T2-PBXIP1，PCR 鑒定片段大小與預(yù)期相符，經(jīng)測(cè)序分析，結(jié)果驗(yàn)證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖 3）。A

圖 3 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定結(jié)果A:代表重組質(zhì)粒 pGEX4T2-RPL10,B:代表重組質(zhì)粒 pGEX4T2-PBXIP1；條帶大小均與目的條帶大小相符，選取條帶 2，7 測(cè)序分析，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功3.2 體外驗(yàn)證 AR-LBD 編碼蛋白與 RPL10、PBXIP1 編碼蛋白間相互作用3.2.1 IPTG 誘導(dǎo) RPL10、PBXIP1 表達(dá)蛋白將含有重組質(zhì)粒 pGEX4T2- RPL10、pGEX4T2-PBXIP1 的大腸桿菌 DH5α中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 IPTG(終濃度 1mmol/L)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，考馬斯亮藍(lán) R250 染膠，脫色后觀察到 RPL10、PBXIP1 融合蛋白成功表達(dá)。3.2.2 體外驗(yàn)證 AR-LBD 編碼蛋白與 RPL10、PBXIP1 編碼蛋白間相互作用

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2775717