【摘要】：[背景與目的]:巨噬細胞源性泡沫細胞的形成是引起動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。因此,抑制泡沫細胞的形成是防治As的重要策略。三磷酸腺苷結合盒式轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)和三磷酸腺苷結合盒式轉運蛋白G1(ATP-binding cassette transporter G1,ABCG1)都是一類整合膜蛋白,它們以ATP為能源促進細胞內游離膽固醇和磷脂的流出到細胞表面乏脂的載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein,apo A-I)或新生的高密度脂蛋白(nascent high-density lipoprotein,n HDL),并轉運至肝臟進行代謝,抑制巨噬細胞內膽固醇大量蓄積,導致巨噬細胞泡沫化,進而抗As的作用。因此,挖掘調控ABCA1和ABCG1的表達機制,促進細胞膽固醇流出,對于As防治具有重要的意義。熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一組高度保守的伴侶蛋白。它可以調節(jié)多種蛋白質的活性和功能,具有維護細胞內環(huán)境穩(wěn)定,提高細胞對應激原的耐受性,增加協(xié)同免疫等功能作用。此外,HSPs在細胞凋亡和炎癥反應中也扮演著重要作用。近幾年研究顯示,心血管疾病患者的血漿中熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)水平明顯的高于正常人,提示HSP70可能與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。相關研究報道,HSP70可以通過巨噬細胞表面Toll樣受體,活化核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)細胞信號通路,激活細胞間粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)、血管細胞粘附分子1(vascular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)及白介素6(interleukin,IL-6)等黏附分子和細胞因子的表達,激活炎癥細胞,引發(fā)炎性反應,促進As的發(fā)生發(fā)展。但是,HSP70是否能夠通過膽固醇逆向轉運影響As及其潛在機制仍不清楚。因此,本研究的目的是從脂質代謝的角度,探究HSP70對膽固醇逆向轉運與As的影響及其潛在機制。該研究有助于明確以HSP70為代表的熱休克蛋白在調節(jié)RCT和As中的作用,為開發(fā)防治As的藥物提供了理論依據和新的靶點。[方法]:采用病毒轉染過表達HSP70,并通過Western Blot檢測轉染效率,進行以下實驗。首先,采用高效液相色譜儀和細胞油紅O染色,檢測HSP70過表達后巨噬細胞內脂質含量情況;運用q PCR和Western Blot,檢測過表達HSP70后對膽固醇轉運蛋白ABCA1和ABCG1表達的影響;通過液體閃爍計數(shù)儀,檢測HSP70對膽固醇流出的影響;采用熒光素酶報告基因和染色質免疫共沉淀分別檢測HSP70對轉錄因子Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動子的結合情況;Elk-1過表達后和JNK激活劑茴香霉素處理后,通過q PCR或Western Blot分別檢測JNK和Elk-1的磷酸化水平與ABCA1和ABCG1的表達情況,驗證HSP70是否通過JNK/Elk-1信號通路影響ABCA1和ABCG1的表達。最后,在apo E-/-小鼠體內過表達HSP70,使用[3H]標記的膽固醇檢測HSP70對小鼠RCT的影響;采用油紅O、HE和Masson染色評估小鼠動脈粥樣斑塊的形成情況;收集小鼠的主動脈,采用q PCR和Western Blot以及免疫熒光等方法,檢測小鼠主動脈和動脈粥樣斑塊中ABCA1和ABCG1表達水平。[結果]:Western Blot檢測結果顯示病毒轉染后HSP70蛋白表達顯著性增加,說明了細胞內過表達HSP70的模型構建成功。通過油紅O染色和高效液相色譜儀檢測表明,過表達HSP70能夠增加巨噬細胞內總膽固醇、膽固醇酯、游離膽固醇的含量;進而檢測HSP70過表達后ABCA1和ABCG1表達水平以及細胞膽固醇流出情況,結果顯示過表達HSP70明顯降低了ABCA1和ABCG1蛋白質和m RNA的水平,減少ABCA1和ABCG1介導的膽固醇流出。進一步探究HSP70調控ABCA1和ABCG1表達的機制。熒光素酶報告基因和染色質免疫共沉淀的結果顯示,HSP70降低了ABCA1和ABCG1啟動子的活性,以及抑制Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動子區(qū)域的結合;q PCR和Western Blot檢測顯示,過表達HSP70顯著性的抑制了Elk-1的活性,但是Elk-1過表達后,能夠逆轉過HSP70對ABCA1和ABCG1的抑制作用,說明了Elk-1是HSP70調控ABCA1和ABCG1表達的關鍵因子;Elk-1位于MAPKs信號通路上,其中JNK是Elk-1的上游,進一步檢測HSP70對JNK的影響,結果表明過表達HSP70阻止了JNK的激活,并且JNK激活劑茴香霉素處理后,能夠恢復Elk-1的活性與ABCA1和ABCA1的表達,證明了HSP70抑制ABCA1和ABCG1的表達通過JNK/Elk-1信號途徑;通過檢測小鼠血漿、肝臟和糞便中[3H]的含量,顯示HSP70能夠降低小鼠體內的RCT效率;小鼠心臟的主動脈瓣的冰凍切片染色顯示,HSP70能夠顯著的促進動脈粥樣斑塊的形成;檢測小鼠主動脈和斑塊內的ABCA1和ABCG1的表達情況,表明過表達HSP70能夠下調ABCA1和ABCG1的表達。[結論]:1.HSP70通過抑制JNK磷酸化,阻止Elk-1與ABCA1和ABCG1啟動子區(qū)域的結合,下調ABCA1和ABCG1的表達,降低其介導的膽固醇流出,促進細胞內脂質蓄積。2.HSP70通過抑制ABCA1和ABCG1的表達,減少HDL水平,降低膽固醇逆向轉運,促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.5
【圖文】：

控的膽固醇流出為切入點，在細胞水平上深入探討 HSP70 對膽固醇流出的影響，并提出 HSP70 通過阻斷 JNK/Elk-1 信號通路，抑制 ABCA1 和 ABCG1 表達及其介導的膽固醇流出和 RCT 效率，引發(fā)脂質代謝紊亂，發(fā)揮致 As 發(fā)生發(fā)展的假說（如圖 1.1）。本課題不僅有助于闡明 HSP70 調控 As 的新機制，明確以 HSP70為代表的熱休克蛋白在調控 RCT 和影響 As 發(fā)生發(fā)展中的作用，同時與明確了JNK/Elk-1 信號通路在調節(jié) ABCA1 和 ABCG1 及其介導的膽固醇流出的作用，豐富了膽固醇流出的調控機制，為開發(fā)防治 As 的藥物提供了新的靶點和理論依據。綜合以上文獻分析和本課題組的前期研究基礎，我們提出 HSP70 通過JNK/Elk-1 信號通路下調 ABCA1 和 ABCG1 的表達，抑制膽固醇流出，促進泡沫細胞形成，加劇 As 發(fā)生發(fā)展的科學問題。

第 4 章 實驗結果第 4 章 實驗結果增加巨噬細胞內脂質蓄積用病毒載體轉染 THP-1 源性的巨噬細 Western Blot 檢測其轉染效率，其結果達明顯高于對照組和病毒空載體轉染組（

圖 4.1 巨噬細胞內 HSP70 病毒載體轉染效率情況**P<0.01 與 Control 組比較（n=3）接著，油紅 O 染色檢測 HSP70 過表達后，巨噬細胞內脂質蓄積水平。結，HSP70 過表達后，巨噬細胞內被染成紅色的區(qū)域與對照組和病毒空載體較明顯增多（如圖 4.2），說明了 HSP70 可能能夠促進巨噬細胞內脂質蓄

【參考文獻】

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本文編號：2771962