【摘要】：一、研究背景心房顫動(Atrial fibrillation,AF)是最嚴重的心房電活動紊亂,也是臨床上最常見的心律失常。關(guān)于AF的具體發(fā)生機制尚未完全明確,這嚴重制約著臨床上AF治療的有效性及安全性。大量研究表明,心房肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)異常,特別是鈣泄漏是AF發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。而鈣穩(wěn)態(tài)主要受到心肌細胞肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum,SR)上雷尼丁受體(Ryanodine receptor 2,RyR2)的調(diào)控。RYR2作為最主要的鈣釋放通道,在心肌的舒張期應保持理想的關(guān)閉狀態(tài)。如舒張期RyR2異常開放,會引起肌漿網(wǎng)的鈣泄漏(Ca~(2+)leak)增多,Ca~(2+)通過胞膜上的鈉鈣交換體(NCX)外排,產(chǎn)生異常的凈內(nèi)向陽離子移動,進而導致心肌細胞延遲后除極(Delayed afterdepolarization,DAD)。一旦達到心肌細胞興奮的閾值,即可誘發(fā)自發(fā)性的動作電位(action potential,AP);如多處心肌細胞同步出現(xiàn)自發(fā)AP等異位電觸發(fā)活動,在業(yè)已存在心房擴大或纖維化等心房重構(gòu)基質(zhì)的基礎上,則可引發(fā)AF。晚近研究發(fā)現(xiàn),RyR2的穩(wěn)定性受到親聯(lián)蛋白(Junctophilin,JPH)-2(JPH2)的調(diào)控,JPH2可通過和RyR2結(jié)合對影響RyR2的穩(wěn)定性。近來研究發(fā)現(xiàn),快速心房搏動導致心肌細胞內(nèi)鈣濃度增加,可激活Calpain-Ⅰ,而且其激活程度隨AF持續(xù)時間的延長而逐漸增高,因此我們推測,高頻率心房搏動可導致心房肌細胞內(nèi)Ca~(2+)超載,進而可能激活Calpain-Ⅰ,降解JPH2蛋白,導致鈣泄漏增多,最終引發(fā)AF的發(fā)生。本研究擬通過臨床及動物研究明確在AF發(fā)生中Calpain-Ⅰ與JPH2蛋白水平的相關(guān)關(guān)系。二、研究目的1、明確Calpain-Ⅰ/JPH2與人房顫發(fā)生的相關(guān)性;2、明確快速心房起搏通過誘導Calpain-Ⅰ/JPH2表達變化,影響鈣穩(wěn)態(tài),導致房顫的發(fā)生。三、研究方法(一)房顫患者左心房Calpain-I與JPH2的表達變化研究1、研究對象選取在海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院心臟外科行瓣膜手術(shù)的患者64例,所有患者簽署手術(shù)知情同意書及剩余標本使用知情同意書。2、研究分組根據(jù)患者病史及術(shù)前心電圖將患者分為兩組:房顫組(AF組,n=32)和竇性心律組(SR組,n=32)。3、標本及臨床資料采集收集手術(shù)中切除的左心房(LAA)及所有入院患者的一般臨床資料。4、分子生物學指標檢測(1)采用組織塊酶消化及熒光染色的方法,評價心房肌細胞胞內(nèi)鈣離子濃度;(2)利用試劑盒檢測不同分組心房肌組織Calpain-Ⅰ酶活;(3)性采用Q-PCR方法檢測不同分組JPH2 mRNA表達水平:(4)采用Western blot方法檢測不同分組JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表達水平;(二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相關(guān)性及其與房顫發(fā)生的動物實驗研究1、兔AF模型的建立與鑒定(1)研究對象:成年新西蘭大白兔,體重約2.0-2.5kg;(2)模型制備及實驗分組:開胸將刺激電極縫合與左心耳表面,用閾上刺激連續(xù)刺激,觀察刺激有效后關(guān)胸。手術(shù)組依據(jù)實驗要求分為RAP組和RAP+Calpain-Ⅰ抑制劑組,RAP組在術(shù)后1w后開始RAP連續(xù)起搏4w,同時予以腹腔注射二甲基亞砜制劑(DMSO,MDL28170的溶劑),連續(xù)給藥4w。RAP+Calpain-Ⅰ抑制劑組在術(shù)后1w后開始RAP連續(xù)起搏4w,同時腹腔注射帶有MDL28170(Calpain-Ⅰ特異性抑制劑)的溶液,連續(xù)給藥4w。假手術(shù)組僅進行開關(guān)胸操作,在術(shù)后1w后開始腹腔注射DMSO,連續(xù)給藥4w;(3)模型鑒定:利用遙測系統(tǒng)記錄兔AF發(fā)生情況及持續(xù)時程(5min為持續(xù)性AF,5min并且能夠自行終止者為非持續(xù)性AF或陣發(fā)性AF)。2、標本采集術(shù)后5周處死實驗動物,部分用于分離心肌細胞,部分用于分子生物學指標檢測。3、分子生物學研究(1)利用試劑盒檢測不同分組Calpain-Ⅰ酶活性;(2)采用Q-PCR方法檢測不同分組JPH2 mRNA表達水平;(3)采用Western blot方法檢測不同分組JPH2及Calpain-Ⅰ蛋白表達水平;(4)采用Langendorff灌流及熒光染色法,評價心房肌細胞內(nèi)鈣離子濃度:(三)統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析,P0.05表示差異存在統(tǒng)計學意義。四、研究結(jié)果(一)房顫患者左心房Calpain-I與JPH2的表達變化研究1、AF組與SR組患者一般臨床資料無明顯差異(P0.05);但AF患者LAD明顯大于SR組患者(53.97±8.37 vs 41.81±8.18,P0.05)。2、AF組心肌細胞內(nèi)鈣離子相關(guān)的熒光強度明顯高于SR組,且AF組細胞內(nèi)平均熒光強度明顯高于SR組(20.56±1.98 vs 8.92±1.26,P0.01)。3、以SR的OD值為基準,AF組Calpain-Ⅰ酶活性明顯高于SR組(P0.05)。4、以SR組的mRNA表達量為基準,AF組患者左心房肌組織中JPH2 mRNA的表達水平與SR組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。5、AF組JPH2蛋白表達較SR組明顯下調(diào)(0.53±0.14 vs 0.82±0.27,P0.01);但AF組Calpain-Ⅰ蛋白表達較SR組顯著上調(diào)(0.89±0.09 vs 0.46±0.09,P=0.015)。6、AF組左心房肌JPH2蛋白水平與Calpain-Ⅰ酶活性呈現(xiàn)明顯負相關(guān)(P0.01)。(二)左心房Calpain-Ⅰ/JPH2蛋白水平相關(guān)性及其與房顫發(fā)生的動物實驗研究1、Calpain-Ⅰ抑制劑可降低RAP導致的房顫發(fā)生率(P0.01)。2、Calpain-Ⅰ抑制劑可降低RAP導致的酶活性增加(P0.01)。3、Calpain-Ⅰ抑制劑對JPH2 mRNA表達水平無影響(P0.05)。4、Calpain-Ⅰ抑制劑可抑制RAP導致的JPH2蛋白降解(P0.05)。5、房顫兔心房肌中JPH2蛋白水平與Calpain-Ⅰ酶活性呈現(xiàn)明顯負相關(guān)(P0.01)。6、Calpain-Ⅰ抑制劑可降低RAP導致的心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度增加(P0.01)。五、研究結(jié)論(一)Calpain-Ⅰ/JPH2與人房顫發(fā)生密切相關(guān);(二)Calpain-Ⅰ可通過降解JPH2蛋白,影響心房肌細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài),誘發(fā)房顫的發(fā)生。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R541.75
【圖文】：

文- 12 -s）、鈣波 （Ca2+wave）等，從而導致胞質(zhì)穩(wěn)態(tài)[17,18]。在這種情況下（圖 1），Ca2+通胞外的 Na+以 1:3 的比例進行交換，會產(chǎn)生流（Transient inward current, Iti），進而導olarization, DAD）。一旦達到心肌細胞興奮ction potential, AP）；如多處心肌細胞同步出存在心房擴大或纖維化等心房重構(gòu)基質(zhì)的

Calpain-I 通過 Junctophilin-2 影響房顫發(fā)生的Ca2+release unit, CRU）超微結(jié)構(gòu)，調(diào)控 SR 鈣循環(huán)平衡，保障心臟正常功要作用[26][27][28]。Hou 等[29]采用雙熒光隨機光學重建顯微鏡（Dual-cM）觀察大鼠心肌細胞，結(jié)果提示 RyR2 簇與同樣呈簇狀排列的 JPH2 距在大約 80%的部位兩者表現(xiàn)為空間共定位；Song 等[30]報道，JPH2 參與心結(jié)構(gòu)重構(gòu)及鈣穩(wěn)態(tài)異常，在心肌肥大導致心力衰竭的發(fā)展過程中發(fā)揮重用 JPH2-E169K 突變的肥厚性心肌病患者心房肌標本進行研究發(fā)現(xiàn)，RyR合減少，RyR2 通道開放概率（open probability, Po）增大，肌漿網(wǎng)異常增多（圖 2）[24]。提示 JPH2 能和 RyR2 結(jié)合，并可能對 RyR2 穩(wěn)定性發(fā)。那么，JPH2 蛋白表達水平的變化又究竟受何種因素的調(diào)節(jié)進而影響 A？

圖 3: 兩組患者左心房肌細胞內(nèi)鈣離子熒光強度光掃描共聚焦顯微鏡圖像處理軟件和 imagej 軟件計算兩組患者心強度與細胞面積的比值（平均熒光強度）（如圖 4，表 2），AF 組度明顯高于 SR 組（20.56±1.98 vs 8.92±1.26 , P＜0.01）。SR AFSR AF

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本文編號：2761786