發(fā)布時(shí)間：2020-07-09 12:02

【摘要】：多種心血管疾病可導(dǎo)致心肌肥大,處于失代償階段的肥大心肌細(xì)胞,除了收縮舒張功能下降之外,也會(huì)出現(xiàn)電生理活動(dòng)的紊亂,由此誘發(fā)心律失常的發(fā)作。開(kāi)發(fā)既能夠抗心肌肥大,又能夠抗心律失常的藥物,顯得尤為重要。葛根素(Puerarin)具有多種藥理活性,既往研究證實(shí)葛根素可以抑制心肌肥大,但對(duì)于葛根素的抗心律失常作用,特別是針對(duì)人源肥大心肌細(xì)胞的抗心律失常作用,則未見(jiàn)報(bào)道。目的:探討葛根素對(duì)人源肥大心肌細(xì)胞電生理活動(dòng)的影響。方法:從健康人體排出的尿液中提取上皮樣細(xì)胞,然后將攜帶Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染上皮樣細(xì)胞,經(jīng)重編程得到人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Human Induced pluripotent stem cells,hIPSCs),并檢測(cè)其多能性。將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞單層培養(yǎng),并在細(xì)胞生長(zhǎng)不同階段加入WNT信號(hào)通路激活及抑制劑的時(shí)序性調(diào)控方法,將人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞。然后模擬心肌肥大患者體內(nèi)局部ET-1濃度的明顯升高,通過(guò)培養(yǎng)基中加入ET-1來(lái)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大,制作肥大心肌細(xì)胞模型。利用實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀進(jìn)行葛根素對(duì)心肌細(xì)胞的安全性檢測(cè)。最后運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),測(cè)定葛根素對(duì)肥大心肌細(xì)胞電生理活動(dòng)的影響。結(jié)果:成功地從人體排出的尿液中提取上皮樣細(xì)胞,對(duì)獲得的hIPSCs進(jìn)行堿性磷酸酶及多能標(biāo)志物的免疫熒光染色,同時(shí)也進(jìn)行了畸胎瘤形成試驗(yàn),證實(shí)獲得的hIPSCs具有多能性,并對(duì)獲得的hIPSCs進(jìn)行了染色體核型分析,結(jié)果顯示其染色體核型正常。hIPSCs定向分化為心肌細(xì)胞,可表達(dá)肌鈣蛋白(TNNT2)和a-肌動(dòng)蛋白(a-actinin)以及心肌特異基因NKX2-5、MYL2、MYH6和MYH7。用ET-1誘導(dǎo)人源心肌細(xì)胞,觀察到心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大反應(yīng),檢測(cè)到BNP、α-actinin明顯升高,MYH7/MYH6比值增大。實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀結(jié)果提示,系列濃度葛根素對(duì)心肌細(xì)胞的cell index、beating rate、amplitude影響不大。肥大心肌細(xì)胞組以及葛根素后處理組輕微延長(zhǎng)hiPSC-CMs APD90,明顯延長(zhǎng)了APD50和APD30,延長(zhǎng)了心肌細(xì)胞動(dòng)作電位整體時(shí)程。心肌細(xì)胞動(dòng)作電位0期除極幅度(APA)沒(méi)有顯著性差異,對(duì)0期最大除極速度(Vmax)有明顯減小的作用。與對(duì)照組相比,肥大心肌細(xì)胞組鈉通道峰值電流密度顯著降低。葛根素組及葛根素后處理組不能改善肥大心肌細(xì)胞鈉通道的電流。但是,葛根素預(yù)處理可以改善肥大心肌細(xì)胞鈉電流。各組激活曲線、失活曲線V50及Slope和恢復(fù)曲線Tau之間的比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:獲得的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可定向分化為心肌細(xì)胞,其電生理學(xué)高度近似于成人心室肌細(xì)胞;葛根素對(duì)肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的0期最大除極速度有改善作用,其機(jī)制可能是通過(guò)增加INa峰值密度。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R54
【圖文】：

邐博士學(xué)位論文貼壁現(xiàn)象，見(jiàn)圖１－１Ｂ。繼續(xù)培養(yǎng)，可觀察到上皮樣細(xì)胞開(kāi)始增殖，見(jiàn)圖１－１Ｃ。逡逑繼續(xù)培養(yǎng)至第７天及第１０天，可觀察到上皮樣細(xì)胞增殖更為明顯，見(jiàn)圖１－１及圖１－１Ｅ。培養(yǎng)至第１０天觀察細(xì)胞團(tuán)足以傳代，使用０．２５％胰酶消化進(jìn)行傳代細(xì)胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)，直至Ｐ２代（圖１－１Ｆ），可開(kāi)始啟動(dòng)重編程，并凍存部保種。逡逑

２．２上皮樣細(xì)胞重編程逡逑轉(zhuǎn)染當(dāng)天，可觀察到上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞完全貼壁和伸展，見(jiàn)逡逑圖１－２Ａ。轉(zhuǎn)染后１２天可以觀察到克隆的形成，見(jiàn)圖１－２Ｂ；轉(zhuǎn)染后２８天，克隆逡逑生長(zhǎng)到合適的大小用于轉(zhuǎn)移，見(jiàn)圖１－２Ｃ；挑取克隆，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿上用于逡逑進(jìn)一步的擴(kuò)增和分析，見(jiàn)圖１－２Ｄ。逡逑圖１－２上皮樣細(xì)胞重編程圖片逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ邋ｏｆ邋ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｉｄ邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．３邋ＩＰＳＣｓ免疫熒光染色逡逑用免疫熒光染色法檢測(cè)上皮樣細(xì)胞重編程所獲得的ＩＰＳＣｓ的多能標(biāo)記物，逡逑包括邋ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４邋的表達(dá)情況，可檢逡逑測(cè)到這些多能標(biāo)記物在活動(dòng)的ＩＰＳＣｓ細(xì)胞中均可表達(dá)，見(jiàn)圖１－３。逡逑１８逡逑

第一部分獲得人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞ｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｉｍａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ＩＰＳＣｓ邋（Ａ＞邋Ｄ＞逡逑、Ｍ、Ｐ邋ａｒｅ邋ＤＡＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ；邋Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ邋ａｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴＲＡ－１－ＴＲＡ－１－８１、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ－４；Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ、Ｒａｒｅ邋ｍｅｒｇｅｒ）逡逑．４邐ＩＰＳＣｓ核型分析結(jié)果逡逑ＩＰＳＣｓ進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示，染色體４６條，核型正常，見(jiàn)圖１

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8 王s

本文編號(hào)：2747426