【摘要】：目的MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中具有調(diào)控功能的非編碼RNA,目前對miRNAs在心肌損傷中的作用的研究很少。本課題主要探究了miR-762在心肌損傷中的作用。方法我們將小鼠原代心肌分為空白對照組和缺氧/復氧(A/R)處理的實驗組,用高通量microRNAs基因芯片對收取的兩組樣品中的miRNA的表達譜進行差異性篩選。用qPCR對篩選出的miRNAs進行驗證,并篩選出miR-762這個基因。采用缺氧/復氧(A/R)的處理對小鼠原代心肌細胞造成損傷后,使用qPCR檢測miR-762在胞液和線粒體中的表達情況,并用熒光原位雜交技術(shù)和免疫共沉淀實驗對其做出定位。設計與miR-762互補的化學修飾的antagomir以抑制內(nèi)源miR-762和antagomir陰性對照(anta-NC)的表達,并經(jīng)過A/R處理使心肌細胞受損,我們將其分為四組(對照,A/R,A/R+anta-NC,A/R+anta-762)。然后通過ATP含量、活性氧(ROS)水平、線粒體復合物活性和細胞凋亡等指標來檢測心肌細胞受損時抑制miR-762的表達對心肌細胞和線粒體造成的影響。我們按照實驗需要對小鼠進行了四組處理,antagomir以抑制內(nèi)源miR-762和陰性對照(anta-NC)的表達,并采用心臟缺血再灌(ischemia/reperfusion,I/R)的方式建立小鼠心梗模型(Sham,I/R,I/R+anta-NC,I/R+anta-762)。然后收取正常的心臟組織和經(jīng)I/R處理后的心臟組織,用qPCR檢測miR-762在小鼠心梗后的表達情況,同時檢測了線粒體復合物活性,細胞凋亡情況,心梗面積及心臟功能。結(jié)果(1)對miRNA基因芯片的結(jié)果進行分析并用qPCR驗證后,我們發(fā)現(xiàn)與對照相比A/R處理后miR-762在線粒體中的表達明顯升高。(2)miR-762主要定位于細胞質(zhì)的線粒體中。(3)A/R處理會使原代心肌細胞受損并刺激miR-762的表達,而antagomir miR-762(anta-762)可以有效地抑制由心肌損傷引起的miR-762的表達。抑制miR-762的表達可以顯著地抑制由A/R誘導的ATP的降低,抑制由A/R誘導的活性氧水平升高,抑制由A/R誘導的線粒體復合物活性的降低,并減少了心肌細胞的凋亡。(4)心臟缺血再灌(I/R)會使小鼠心臟受損甚至梗死,心梗區(qū)域的miR-762表達會升高。當抑制了miR-762的表達并對小鼠心臟進行I/R處理后,線粒體復合物I活性升高,細胞凋亡減少,心梗的面積減少,并且心臟功能恢復。結(jié)論我們通過A/R處理使小鼠原代心肌細胞受損,然后使用基因芯片篩選到了在受損的心肌細胞線粒體中高表達的miR-762這個分子。經(jīng)過實驗探究我們得出了以下的結(jié)論:(1)在受損的心肌細胞線粒體中miR-762的表達會顯著升高。(2)抑制miR-762的表達可以顯著地抑制由心梗導致的ATP的降低,活性氧水平升高,抑制心肌損傷造成的線粒體復合物活性的降低,并減少了心肌細胞的凋亡。(3)通過抑制miR-762的表達來恢復受損心臟中線粒體功能和心臟功能的新途徑。這為治療心梗等心臟疾病和線粒體相關(guān)疾病提供了一種新的治療策略。
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R542.22
【圖文】：

1 MiRNA 芯片篩選結(jié)果圖。原代心肌細胞隨機分組為空白對照組和缺氧/復氧實驗組，其中 miR-762 差異性最顯著，P<0.05。R-762 在線粒體中的表達情況我們提取了正常情況下小鼠原代心肌細胞的總 RNA 和線粒體 RNA，用 miR-762 的表達量，發(fā)現(xiàn)線粒體中 miR-762 的表達占總 RNA 的一半多（明 miR-762 主要在線粒體中富集。將小鼠原代心肌細胞隨機分為空白對 處理組進行培養(yǎng)后提取胞液和線粒體 RNA，同樣用 qPCR 檢測 miR-76況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過A/ R處理后miR-762的水平是上調(diào)的，而且線粒體中m調(diào)十分明顯（圖 2B），這說明 A/ R 處理會引起線粒體中 miR-762 的水平

圖 2 A. 小鼠原代心肌細胞的總 RNA 和線粒體 RNA，用 qPCR 檢測 miR-762 的表達量。B.小鼠原代心肌細胞隨機分為空白對照組和 A/ R 處理組進行培養(yǎng)后提取胞液和線粒體 RNA，用qPCR 檢測 miR-762 的表達情況，P＜0.05，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義。3 miR-762 在細胞中的定位將分離的原代心肌細胞鋪片培養(yǎng)，48h 后將玻片取出進行熒光原位雜交實驗。用 0.02 μM MitoTracker 將線粒體染為紅色，用 LNATM microRNA 探針雙 DIG 標記miR-762，通過用標記的核酸（LNA）探針進行熒光原位雜交來檢測 miR-762，用DAPI 染細胞核，最后使用激光掃描共聚焦顯微鏡對熒光成像。我們發(fā)現(xiàn) miR-762主要定位于胞質(zhì)的線粒體中（圖 3A）。將收取的原代心肌細胞，使用 Ago2 特異性抗體進行免疫共沉淀，并且用正常IgG 抗體作為陰性對照。免疫共沉淀最后收取的珠子，一半珠子用 100mM 甘氨酸洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，另一半用 TRIzol 分離 RNA。MiR-762 從細胞核中輸出后會和 Ago2相結(jié)合，然后通過膜蛋白 Tom 進入線粒體中。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中有大量的 Ago2蛋白，且與陰性對照組相比Ago2組中miR-762表達水平特別高，這可以說明miR-762

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10 ;測定血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ提高輕度缺血性心肌損傷的診斷[J];國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊);1999年01期

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本文編號：2741655