【摘要】：【背景】動脈粥樣硬化(As)為動脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致的慢性炎癥增生性反應(yīng),好發(fā)于動脈的分支和分叉等低剪切應(yīng)力區(qū)域。前期研究表明,TET2為DNA羥甲基化酶,低剪切應(yīng)力下調(diào)TET2表達(dá),過表達(dá)TET2抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的As病變。【目的】探討TET2對低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其作用機(jī)制。【方法】采用平行平板流動腔系統(tǒng)分別在低剪切應(yīng)力(4dyn/cm~2)、生理層流剪切應(yīng)力(15dyn/cm~2)環(huán)境下灌流6小時,觀察低剪切應(yīng)力對EndMT以及TET2表達(dá)的影響;TET2 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)構(gòu)建低表達(dá)TET2血管內(nèi)皮細(xì)胞,觀察TET2shRNA對EndMT的影響以及Wnt/β-Catenin信號通路下游靶基因MYC與AXIN2表達(dá)的影響;LV-TET2慢病毒轉(zhuǎn)染HUVECs構(gòu)建高表達(dá)TET2血管內(nèi)皮細(xì)胞,采用平行平板流動腔系統(tǒng),低剪切應(yīng)力條件下灌流6小時,觀察TET2過表達(dá)對低剪切應(yīng)力下EndMT的影響。Western Blot免疫印跡檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31、VE-Cadheri-n、Pecam1的表達(dá)、間充質(zhì)細(xì)胞表面抗原Vimentin、α-SMA、FSP-1的表達(dá)、Wnt/β-Catenin信號通路下游靶基因MYC與AXIN2的表達(dá)以及TET2的表達(dá)。羅丹明鬼筆環(huán)肽染色檢測TET2 shRNA對血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、骨架的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TET2 shRNA對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響;MTT實(shí)驗(yàn)檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的情況;流式細(xì)胞儀檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的變化。【結(jié)果】與生理層流剪切應(yīng)力相比,低剪切應(yīng)力組血管內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原VE-Cadherin的表達(dá)顯著下降,然而間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原Vimentin表達(dá)明顯上調(diào),表明低剪切應(yīng)力促EndMT。同時,低剪切應(yīng)力組TET2的表達(dá)較生理層流組低,說明低剪切應(yīng)力下調(diào)TET2的表達(dá)。Western blot檢測顯示:TET2 shRNA下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VE-Cadherin、CD31、Pecam1的表達(dá),上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、α-SMA、FSP-1的表達(dá),表明TET2 shRNA促EndMT。TET2 shRNA上調(diào)Wnt/β-Catenin信號通路下游靶基因MYC、AXIN2的表達(dá),表明TET2表達(dá)下調(diào)可以激活Wnt/β-Catenin信號通路。低剪切應(yīng)力環(huán)境下,LV-TET2組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物VE-Cad-herin、CD31的表達(dá)增加,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin、α-SMA的表達(dá)下調(diào),表明LV-TET2抑制低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的EndMT。羅丹明鬼筆環(huán)肽染色的結(jié)果表明,TET2 shRNA組HUVECs微絲增粗、應(yīng)力纖維增加,細(xì)胞骨架重排。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TET2 shRNA組HUVECs的遷移能力增強(qiáng)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:TET2 shRNA組的HUVECs增殖與對照組相比無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明:TET2 shRNA組的細(xì)胞周期與對照組相比無明顯差異�！窘Y(jié)論】低剪切應(yīng)力下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞TET2的表達(dá),上調(diào)MYC、AXIN2的表達(dá),促EndMT。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 建立 TET2 高表達(dá)、低表達(dá)的血管內(nèi)皮細(xì)胞使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將 LV-TET2、TET2 shRNA 轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別構(gòu)建低表達(dá) TET2 以及高表達(dá) TET2 的血管內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 96 小時后，采用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高(圖 3.1），符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖 3.2 低剪切應(yīng)力對 VE-Cadherin 和 Vimentin 表達(dá)的影響低剪切應(yīng)力下調(diào) VE-Cadherin 表達(dá)；B.低剪切應(yīng)力上調(diào) Vimentin**P<0.01vs 15dyn/cm2組，n=3。剪切應(yīng)力下調(diào) HUVECs TET2 的表達(dá)用 Western blot 檢測低剪切應(yīng)力對 HUVECs TET2 蛋白表達(dá)的影剪切應(yīng)力下調(diào) HUVECs TET2 的表達(dá)（圖 3.3）。

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本文編號：2740831