【摘要】：目的:動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病,內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié),CXC趨化因子配體16(CXCL16)作為黏附分子、趨化因子及清道夫受體參與其中。我們的研究目的在于探索(1)炎性損傷因素脂多糖(LPS)是否影響內(nèi)皮細(xì)胞CXCL16表達(dá)及其作用途徑;(2)與炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的miR-146a對(duì)LPS誘導(dǎo)的CXCL16表達(dá)的調(diào)控及作用機(jī)制。方法:采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),給予LPS炎性刺激,構(gòu)建炎性細(xì)胞模型;通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-146a作用靶點(diǎn);通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-146a模擬體(miR-146a mimics)或miR-146a抑制劑(miR-146a inhibitors),過(guò)表達(dá)或抑制內(nèi)皮細(xì)胞中miR-146a表達(dá);通過(guò)Cell Counting Kit-8(CCK-8)方法觀察內(nèi)皮細(xì)胞活性變化,免疫熒光觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況;采用分子生物學(xué)技術(shù)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中CXCL16表達(dá),蛋白印跡(Western blotting)檢測(cè)細(xì)胞CXCL16及信號(hào)通路分子Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)蛋白表達(dá),實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-146a表達(dá)水平。結(jié)果:(1)利用濃度梯度(0-10ug/mL)及時(shí)間梯度(0-48h)的LPS干預(yù)HUVECs,與空白對(duì)照組相比,在1、3、10ug/mL(24h)及6、12、24、48h(1ug/mL)內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯降低(P0.05);CXCL16在LPS濃度1ug/mL時(shí)釋放及表達(dá)增加,時(shí)間越長(zhǎng),內(nèi)皮細(xì)胞釋放及表達(dá)CXCL16明顯增加(P0.05)。(2)利用LPS誘導(dǎo)HUVECs,檢測(cè)信號(hào)通路TLR4、phosphor-NF-κB p65、NF-κB p65是否被激活。結(jié)果顯示,TLR4、phosphor-NF-κB p65在1ug/mL LPS濃度下表達(dá)明顯增加;在作用時(shí)間上,TLR4及phosphor-NF-κB p65均在24小時(shí)變化明顯(P0.05)。給予TLR4的抑制劑TAK-242(10uM,12h),阻斷TLR4后,選擇1ug/mL的LPS繼續(xù)干預(yù)24小時(shí),與空白組相比,TAK-242抑制劑組TLR4及下游NF-κB表達(dá)明顯減少;并且TAK-242抑制劑組,細(xì)胞釋放及表達(dá)CXCL16相較于空白組明顯降低(P0.05)。(3)利用LPS誘導(dǎo)HUVECs,檢測(cè)miR-146a表達(dá)。與空白對(duì)照相比,LPS能夠誘導(dǎo)miR-146a表達(dá)明顯增加(P0.05)。進(jìn)一步,通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)及下調(diào)miR-146a表達(dá)后,檢測(cè)CXCL16的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-146a mimics,上調(diào)miR-146a表達(dá)后,相較其對(duì)照組,CXCL16表達(dá)明顯下降;相反的,轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitors,抑制miR-146a作用,CXCL16表達(dá)高于其對(duì)照組(P0.05)。(4)通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)及下調(diào)miR-146a后,檢測(cè)TLR4及phosphor-NF-κB p65表達(dá)。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-146a mimics組,上調(diào)miR-146a表達(dá)后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表達(dá)下降;相反,miR-146a inhibitors組在抑制miR-146a后,TLR4、phosphor-NF-κB p65表達(dá)增加。我們?cè)诮o予TLR4的抑制劑TAK-242(10uM,12小時(shí))基礎(chǔ)上,同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitors,檢測(cè)TLR4/NF-κB通路,及CXCL16的表達(dá)變化。結(jié)果顯示抑制劑TAK-242明顯阻斷了miR-146a inhibitor干預(yù)后上清及細(xì)胞高表達(dá)的CXCL16,并且TLR4、phosphor-NF-κB p65通路蛋白有相同的趨勢(shì)(P0.05)。結(jié)論:(1)LPS能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞CXCL16釋放及表達(dá)增加;(2)LPS通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)HUVECs中CXCL16表達(dá)變化;(3)在LPS誘導(dǎo)下HUVECs中,miR-146a表達(dá)增加,通過(guò)作用于TLR4,負(fù)反饋調(diào)控CXCL16的表達(dá)。
【圖文】：

（1） 將血球計(jì)數(shù)板擦拭干凈，并將蓋玻片置于計(jì)數(shù)板上；（2） 制備懸液：按照 2.2.2 中方法進(jìn)行，鏡下觀察呈單細(xì)胞懸液；（3） 將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，注意蓋片下不要有氣泡；（4） 統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)板外周 4 格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的；（5） 計(jì)算細(xì)胞數(shù)：按照公式計(jì)算細(xì)胞密度：細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×104。2.2.5 細(xì)胞活性檢測(cè)使用 Cell Counting Kit-8 進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，具體步驟參照 Cell Counting Kit-8（MCE）說(shuō)明書(shū)。（1） 在 96 孔板中接種 HUVECs 懸液(100 μL/孔，細(xì)胞密度約 6-8×103/mL)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 小時(shí)；（2） 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要產(chǎn)生氣泡)；（3） 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)；（4） 分別在 1、2、3、4h 時(shí)使用酶標(biāo)儀測(cè)定在 450 nm 處的吸光度（OD 值）。

圖 2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染鏡下觀察（a 光鏡鏡下圖像，b 同視野熒光顯微鏡鏡下圖像）2.4 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）檢測(cè) miR-146a 表達(dá)（1）RNA 提�、� 細(xì)胞裂解：吸取培養(yǎng)基，加冰 PBS 沖洗 2 遍；加 Trizol 裂解液（每 10cm2加入 1mL），輕微研磨混勻處理；② 提取 RNA：將勻漿液移至 EP 管中，加入 200μL 的氯仿（1/5 體積的 Trizol），旋渦振蕩 15 秒，，冰上靜置 10min，待分層； 4℃，12000rpm 離心 15min，勻漿液分至 3 層；③ 沉淀 RNA：取上層上清液，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，冰上靜止 20min；4℃，12000rpm 離心 15min，可見(jiàn) RNA 沉淀；④ 洗滌 RNA：去除上清，加入等 Trizol 體積的 75%乙醇溶液（DEPC 水 25% + 75%無(wú)水乙醇），輕微混勻；4℃，7500rpm 離心 10min，可見(jiàn) RNA 沉淀；可重復(fù)
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2690540