【摘要】：背景同型半胱氨酸(Homocystein,Hcy)是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,參與心血管和腦血管事件的發(fā)生。有研究已證實(shí)Hcy氧化過程中通過含有金屬的酶蛋白催化,產(chǎn)生活性氧物質(zhì),進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙。此外臨床研究表明診斷為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)的患者,血漿Hcy和Cu2+的濃度同步升高,且兩者呈正相關(guān),而此現(xiàn)象在患有心血管疾病人群中尤為常見。這表明在Hcy損傷內(nèi)皮細(xì)胞過程中Cu2+起重要作用。并且隨著對(duì)Hcy-Cu復(fù)合物新的認(rèn)知,發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中Hcy-Cu復(fù)合物也起到了非常重要的作用。ZnMoS4是一種具有對(duì)銅離子極高選擇性的新型納米顆粒離子交換劑,不僅能穿透細(xì)胞膜充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的銅解毒劑,還能保持其他必須生物金屬離子的穩(wěn)態(tài)。我們前期研究已證實(shí):與單獨(dú)Hcy、Cu2+處理培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比,Hcy聯(lián)合Cu2+可明顯加重對(duì)細(xì)胞的損傷,降低細(xì)胞存活率。其機(jī)制可能是Hcy依賴Cu2+作用激活糖酵解通路和NADPH氧化酶,抑制谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化系統(tǒng),生成過多ONOO-造成內(nèi)皮氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步動(dòng)物體內(nèi)證明Hcy可聯(lián)合Cu2+對(duì)血管產(chǎn)生更嚴(yán)重的損傷和損傷的可能機(jī)制,并探討ZnMoS4對(duì)Hcy損傷大鼠主動(dòng)脈的保護(hù)作用,以及推測(cè)Hcy-Cu復(fù)合物的可能分子式。第一部分Hcy損傷大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮目的:探討Hcy對(duì)大鼠主動(dòng)脈具有的損傷作用。方法:建立HHcy大鼠模型,選取10只6周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為2組,每組5只:①正常蛋氨酸組(4.6g/kgMet);②高蛋氨酸組(7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測(cè)大鼠體重,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后眼球動(dòng)脈采血檢測(cè)血清中Hcy溶度;解剖大鼠取主動(dòng)脈用于血管環(huán)張力測(cè)定、HE染色、透射電鏡實(shí)驗(yàn),觀察大鼠主動(dòng)脈的損傷程度;結(jié)果:與正常組相比,高蛋氨酸組主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱,主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞明顯破壞并伴有線粒體損傷。結(jié)論:體內(nèi)Hcy濃度增加可損傷主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。第二部分 Hcy聯(lián)合Cu2+損傷主動(dòng)脈的機(jī)制研究目的:探討Hcy聯(lián)合Cu2+損傷主動(dòng)脈的機(jī)制。方法:實(shí)驗(yàn)一:準(zhǔn)備30只6周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組,每組5只:①低銅對(duì)照組(1.6mg/kg Cu);②正常銅對(duì)照組(1Omg/kg Cu);③高銅對(duì)照組(300mg/kg Cu);④低銅+高蛋氨酸組(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet)⑤正常銅+高蛋氨酸組(10mg/kg Cu+7.5g/kgMet);⑥高銅+高蛋氨酸組(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測(cè)各組大鼠體重,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖所有模型大鼠,活體下取出主動(dòng)脈用于血管環(huán)張力測(cè)定、HE染色、透射電鏡實(shí)驗(yàn),觀察大鼠主動(dòng)脈的損傷程度。實(shí)驗(yàn)二:20只6周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組,每組5只:①正常銅對(duì)照組(10mg/kg Cu);②低銅+高蛋氨酸組(1.6mg/kg Cu+7.5g/kgMet);③正常銅+高蛋氨酸組(1Omg/kg Cu+7.5g/kgMet);④高銅+高蛋氨酸組(300mg/kg Cu+7.5g/kgMet);每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測(cè)各組大鼠體重,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后眼球動(dòng)脈采血測(cè)血清乳酸含量,解剖所有模型大鼠活體下取出主動(dòng)脈用于HE染色,免疫組化,熒光染色法檢測(cè)血管ROS及NOX活性;結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:正常銅、低銅、高銅組大鼠主動(dòng)脈血管舒張功能相似,病理結(jié)果未見主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷;正常銅+高蛋氨酸組、低銅+高蛋氨酸組、高銅+高蛋氨酸組血管舒張功能較①②③組明顯減弱,且高銅+高蛋氨酸組正常銅+高蛋氨酸組低銅+高蛋氨酸組;內(nèi)皮細(xì)胞破壞、線粒體損傷程度較前三組明顯增大,高銅+高蛋氨酸組正常銅+高蛋氨酸組低銅+高蛋氨酸組。實(shí)驗(yàn)二:與正常對(duì)照組相比,正常銅+高蛋氨酸組、高銅+高蛋氨酸組主動(dòng)脈己糖激酶Ⅱ、gult1、及NOX亞基蛋白表達(dá)含量增加、ROS和NOX活性明顯增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞破壞、線粒體損傷程度嚴(yán)重,且與銅濃度成正比;3-NT蛋白的表達(dá)隨著銅濃度的增加而減少。結(jié)論:血清中Cu2+的含量不影響正常Hcy對(duì)血管的作用,但在HHcy中,隨著銅含量的增加可加重Hcy對(duì)主動(dòng)脈的損傷,其機(jī)制可能是是通過激活NADPH氧化酶和糖酵解途徑,產(chǎn)生ROS;同時(shí)生成過多ONOO-造成內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。第三部分 納米銅交換劑(ZnMoS4)對(duì)Hcy損傷主動(dòng)脈的保護(hù)作用目的:探討ZnMoS4對(duì)Hcy損傷主動(dòng)脈的保護(hù)作用方法:實(shí)驗(yàn)一:原代提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,將細(xì)胞分為如下四組:①正常組,②Hcy+Cu2+組,③Hcy+Cu2++四硫鉬酸鹽(TM)組(2,5,10,50uM/L),④Hcy+Cu2++納米銅離子交換劑(ZnMoS4)組(2,10,50,100uM/L),加藥處理24小時(shí)后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率;同時(shí)急性藥物毒性試驗(yàn)比較兩者毒性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)二:選取15只6周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組,每組5只:①正常對(duì)照組;②高蛋氨酸組(7.5g/kgMet);③高蛋氨酸組+納米銅螯合劑組(7.5g/kgMet+ZnMoS4):喂養(yǎng)1周后加入ZnMoS4(40ml ZnMoS4加入在2Kg鼠糧中)。每組飼料喂養(yǎng)8周,監(jiān)測(cè)大鼠體重,麻醉后解剖所有模型大鼠,活體下取出主動(dòng)脈用于熒光檢測(cè)儀測(cè)試血管環(huán)NOX活性、HE染色、透射電鏡實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:Hcy+Cu2+加入不同溶度的TM和ZnMoS4均能提高細(xì)胞生存率,但ZnMoS4的毒性比TM小很多。實(shí)驗(yàn)二:與高蛋氨酸組相比,高蛋氨酸+ZnMoS4組大鼠血管環(huán)NOX活性升高程度明顯減小,內(nèi)皮細(xì)胞破壞、線粒體損傷程度顯著減弱。結(jié)論:ZnMoS4對(duì)Hcy損傷主動(dòng)脈具有保護(hù)作用。第四部分 Hcy與Cu2+絡(luò)合物鑒定目的:鑒定Hcy-Cu2+絡(luò)合物方法:采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-TOF)、高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法(ESI-MS)和核磁共振波譜法(NMR)。結(jié)果:高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法色譜圖中出現(xiàn)365.9m/z、367.9m/z、369.98m/z三個(gè)質(zhì)核比相差2的峰譜,核磁共振波譜中Hcy-Cu2+絡(luò)合后峰變少、變寬并發(fā)生位移。結(jié)論:Hcy與Cu2+可形成絡(luò)合物。
【圖文】：

cy濃H度（mol/L）u圖 2.4.1 兩組 SD 大鼠血漿 Hcy 濃度：*表示高蛋氨酸組大鼠血漿 Hcy 濃度與正常組比較 p＜0.054.2 Hcy降低主動(dòng)脈血管環(huán)張力通過觀察各組主動(dòng)脈血管在 1μM PE 預(yù)收縮后，，對(duì)乙酰膽堿的舒張反應(yīng)（ACH 濃度 10-9至 10-5mol/L）。結(jié)果顯示：高蛋氨酸組較正常蛋氨酸組舒分比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），說明 Hcy 可損傷 SD 大鼠主動(dòng)皮依賴性舒張功能。0102030正常蛋氨酸組 高蛋氨酸組

第 2 章 同型半胱氨酸對(duì)大鼠主動(dòng)脈的損傷2.4.3 Hcy損傷主動(dòng)脈內(nèi)皮獲取 HHcy 大鼠主動(dòng)脈用于 HE 染色和透射電鏡檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn) HE 染色結(jié)果中高蛋氨酸組大鼠較正常蛋氨酸組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞缺損、脫落明顯，平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核大小不一、胞漿染色不均，排列紊亂（圖 2.4.3A）。并且通過透射電鏡觀察 SD 大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞線粒體情況可知：正常蛋氨酸組可見內(nèi)皮細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，體積較大，嵴較清晰；而高蛋氨酸組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體形態(tài)腫脹，嵴略少（圖 2.4.3B）。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R54

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10 陳磊,陳建敏,周惠娣,賈均紅,皮s

本文編號(hào)：2682792