【摘要】：目的:本研究將分泌型Klotho(sKL)轉染至骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)內(nèi),通過靜脈注射的方式將sKL修飾的BMSCs移植至已構建的腹主動脈瘤(Abdominal aortic aneurysm,AAA)大鼠模型中。通過細胞培養(yǎng)、病毒制備、組織形態(tài)學和Western Blot等實驗方法,觀察腹主動脈管壁的變化及與衰老、炎癥、氧化應激等相關蛋白的表達情況,以探討分泌型sKL修飾的BMSCs在AAA修復中可能發(fā)揮的作用及相關機制,為AAA的治療提供新的思路。方法:1、體外條件下培養(yǎng)大鼠BMSCs,將其分為3組:N組、GFP組、sKL組。N組作為正常對照組,不作任何處理。GFP組、sKL組分別感染GFP空載重組慢病毒、攜帶Klotho基因的慢病毒表達載體,應用熒光顯微鏡觀察感染效率,蛋白免疫印跡法(Western Blot)技術分別對培養(yǎng)細胞中sKL、P21與P53以及培養(yǎng)基中sKL進行定量分析。2、將Wistar大鼠隨機分為五組:N組、AAA組、MSC組、GFP組、sKL組。N組作為正常對照組,不作任何處理;其余4組進行AAA模型制作,其中AAA組作為AAA實驗組,模型制作完成后不作處理,MSC組、GFP組、sKL組在完成AAA模型后即尾靜脈分別注射BMSCs、攜帶GFP的BMSCs、sKL過表達的BMSCs,每周注射一次(1x10~6個),四周后取血液和腹主動脈,進行相關指標檢測。3、測量動脈管徑,檢測過表達sKL的BMSCs是否浸潤動脈病灶區(qū)域;通過HE染色、地衣紅染色和Masson染色分別觀察動脈管壁的總體變化、彈力板與膠原纖維的形態(tài)。通過β-Gal染色對衰老細胞進行了定位和半定量分析,通過免疫組化技術分別對各組動脈組織中SIRT1、CD45、CD68、α-SMA進行定位和半定量分析,Western Blot技術對血清中sKL以及各組動脈組織中SIRT1、P21、P53、NF-κB、P-AMPKα、AMPKα、MMP-2、MMP-9進行定量分析。結果:1、熒光顯微鏡鏡下觀察BMSCs感染效率,Western Blot檢測BMSCs及其培養(yǎng)基中sKL的含量,其中sKL組相較于N組和GFP組顯著增高。MTT結果表明sKL對BMSCs的增殖無顯著影響。Western blot檢測BMSCs中衰老標志物P53、P21。結果表明,sKL可下調(diào)BMSCs中P53、P21的表達。2、AAA模型4周后取材,直徑測量結果可知,AAA組相較于N組明顯擴張,且呈現(xiàn)明顯的鈣化,MSC組、GFP組以及sKL組相對AAA組明顯減輕,sKL組達到最佳的治療效果。HE染色觀察腹主動脈管壁的形態(tài),由結果可知AAA組較N組動脈管徑增大,伴管壁變薄、破裂,治療組相對于AAA組有很大的改善,其中sKL組效果最佳。地衣紅染色表明,AAA組彈力板斷裂明顯,sKL組可顯著抑制動脈管壁彈力板的斷裂。Masson染色結果可知,AAA組動脈管壁平滑肌細胞明顯減少,中膜處膠原纖維明顯增多,sKL組與AAA組相比,平滑肌細胞明顯增多。3、Western Blot檢測大鼠血清中sKL水平,AAA組中sKL含量相較于N組明顯降低,治療組相對AAA組明顯升高。4、SIRT1免疫組化及Western Blot結果表明,其主要定位于血管中膜平滑肌細胞,在AAA組中,SIRT1明顯下降,治療組與AAA組相比SIRT1含量上升,其中sKL組顯著上升。5、β-Gal衰老細胞染色結果可知,AAA組有大量衰老細胞,治療組衰老細胞明顯減少,sKL組可顯著降低細胞衰老。α-SMA免疫熒光結果可知,N組平滑肌細胞數(shù)量很多,AAA組明顯減少,MSC組及GFP組可看出平滑肌細胞數(shù)量較AAA組增加,sKL組接近于正常水平。Western Blot檢測AAA組織中P53、P21的表達,結果顯示,AAA組中P53、P21高表達,治療組中逐漸下降,sKL組明顯下降。6、免疫組化檢測AAA組織中炎癥細胞CD45、CD68的表達,結果表明陽性細胞主要定位于動脈壁外膜,AAA組中有大量炎癥細胞浸潤,治療后浸潤炎癥細胞減少,其中sKL組最少。Western Blot結果顯示,NF-κB在N組中少量表達,而在AAA組高表達,治療組水平降低,而在sKL組中下調(diào)最為明顯。7、DHE檢測活性氧含量發(fā)現(xiàn),AAA組中有大量的活性氧,治療組逐漸下降,sKL組接近于正常水平。Western Blot檢測氧化應激相關蛋白P-AMPKα及AMPKα在動脈中表達,結果顯示,AAA組P-AMPKα水平低于N組,治療組含量相對上升,sKL組中明顯上升。8、Western Blot證實,AAA組中MMP-2和MMP-9表達上調(diào),治療組均下降,sKL組較為顯著。結論:過表達sKL的BMSCs具有抑制AAA病理性擴張的作用,其作用可能是通過抑制動脈管壁細胞衰老、炎癥反應及氧化應激反應實現(xiàn)。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 實驗結果3.1 Klotho 對 BMSCs 增殖的影響3.1.1 過表達 Klotho 的 BMSCs 構建Klotho 是一種衰老抑制基因，在衰老相關疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。我們將 Klotho 穩(wěn)轉至 BMSCs，以此來探究 sKL 對 BMSCs 的影響。熒光倒置顯微鏡鏡下觀察各組細胞可見，GFP 組和 sKL 組中有大量綠色熒光，N 組未見熒光，表明包裝 Klotho 慢病毒已成功感染至 BMSCs（圖 1）。N GFP sKL

中國醫(yī)科大學碩士學位論文腹主動脈 HE 染色結果可見，N 組動脈壁排列規(guī)則；AAA 組藍色病變部位表明大量鈣沉積，同時管壁變薄、中膜破裂、管徑較正常組明顯擴張；MSC 組和 GFP 組同 AAA 組相比中膜破損情況得到明顯改善；sKL 組腹主動脈結構已接近正常 N 組，，管徑略微擴張（圖 6、圖 7）。N AAA MSC
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R543.1

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