【摘要】：目的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是再生醫(yī)學(xué)研究的重要種子細(xì)胞,盡管成年組織有豐富的分布,但成體MSC一般增殖能力有限,且其獲取也受到一定的限制。人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(hiPSC)分化來源的MSC(hiMSC)具有很高的自我更新與增殖能力,為成體MSC提供了一種潛在的替代來源。本研究擬首先通過對hiMSC功能進(jìn)行系統(tǒng)表征,探討其作為成年MSC的替代來源的可行性;隨后,探討hiPS C穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的體系與方法,為hiMSC移植后的追蹤檢測奠定基礎(chǔ);最后,針對缺血性損傷微環(huán)境,探討通過納米顆粒攜帶miR21調(diào)控hiMSC耐受缺血微環(huán)境的可行性與有效體系,以建立hiMSC移植前體外修飾改善其治療潛能的新方法。方法用MSC誘導(dǎo)培養(yǎng)基直接將hiPSC誘導(dǎo)分化為MSC細(xì)胞(hiMSC);流式鑒定比較hiMSC以及hBMSC表面標(biāo)志物CD11b、CD19、CD90、CD73、CD105;顯微鏡觀察比較hiMSC與hBMSC早期代數(shù)的形態(tài)學(xué)性狀;CCK8檢測比較hi MSC與hBMSC早期增殖能力以及長期增殖能力;實(shí)時定量PCR檢測比較hiM SC與hBMSC多能性以及比較hiMSC與hBMSC旁分泌功能;為構(gòu)建穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)染的hiPSC,首先構(gòu)建雙啟動子慢病毒顆粒,分別驅(qū)動綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)與熒光蟲熒光素酶表達(dá)(Fluc),比較不同方法濃縮慢病毒的效能,以建立優(yōu)化的慢病毒制備體系;隨后,轉(zhuǎn)染標(biāo)記hiPSC,在hiPSC長期增殖與分化過程中檢測報(bào)告基因的表達(dá),確定在hiPSC及其來源細(xì)胞中穩(wěn)定活性的啟動子,從而建立hiPSC穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因標(biāo)記體系;通過超聲乳化制備PLGA納米顆粒并通過瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計(jì)檢測優(yōu)化PLGA納米顆粒與miR21復(fù)合的優(yōu)化比例;通過CCK8檢測評價PLGA納米載體與hiMSC的生物相容性以優(yōu)化納米載體使用劑量;通過熒光染料對PLGA納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記,隨后與hiMSC進(jìn)行孵育,不同時間點(diǎn)觀察納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞的水平,確定最佳孵育時間;在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化PLGA/miR21納米顆粒調(diào)控hiMSC的最佳劑量并探索其有效調(diào)控時間,以建立基于PLGA/miR21納米顆粒體外調(diào)控hiMSC的優(yōu)化體系;以過氧化氫模擬缺血條件下氧化應(yīng)激微環(huán)境,通過細(xì)胞活力檢測等評價上述調(diào)控方法改善hiMSC治療潛能、增強(qiáng)其耐受氧化應(yīng)激微環(huán)境的有效性。結(jié)果hiMSC表面標(biāo)志物CD105、CD90、CD73陽性表達(dá)而CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR陰性表達(dá);hBMSC早期代數(shù)細(xì)胞呈長梭形而hiMSC早期代數(shù)細(xì)胞呈短梭形;hBMSC與hiMSC P6代之前細(xì)胞增殖能力基本一致,而P6代以后hiMSC細(xì)胞增殖能力要強(qiáng)于hBMSC細(xì)胞增殖能力;hiMSC和hBMSC都具有成骨、成脂多能性;hBMSC分泌PLGF、HIF-1α、SDF-1、SCF、bFGF生長因子的能力強(qiáng)于hiMSC,而分泌VEGF的能力比hiMSC弱;超濾管法濃縮慢病毒的GFP轉(zhuǎn)染效率最高;GFP成功標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSC)并在其誘導(dǎo)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞(hiMSC)中穩(wěn)定表達(dá),但是Fluc未能成功標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞;100ug包被PEI的PLGA納米顆�？梢詫�200pmol的miR21全部吸附掉;0ug/ml、20ug/ml、100ug/ml、200ug/mL PEI包被的PLGA納米顆粒與hiMSC孵育7天,CCK8檢測細(xì)胞活力基本一致;hiMSC吞噬PLGA納米顆粒12h后達(dá)到最大吞噬量;QRT-PCR檢測PEI包被的PLGA納米顆粒和lipofectmaine RNAiMAX攜帶的miR21最佳濃度是40nM;PEI包被的PLGA納米顆粒介導(dǎo)的miR21轉(zhuǎn)染組要比lipofectmaine RNAIMAX介導(dǎo)的miR21轉(zhuǎn)染組在過氧化氫模擬缺血條件下氧化應(yīng)激微環(huán)境的生存能力強(qiáng)。結(jié)論成功將hiPSC誘導(dǎo)分化成hiMSC,流式鑒定顯示hiMSC與hBMSC都符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的特征;P6代細(xì)胞之后hiMSC增殖能力強(qiáng)于hBMSC且兩者都具有多能性;hiMSC與hBMSC旁分泌能力有差異,hiMSC可做為hBMSC的良好替代細(xì)胞;GFP在hiPSC及其誘導(dǎo)分化的hiMSC中穩(wěn)定表達(dá);成功驗(yàn)證了在過氧化氫模擬缺血條件下氧化應(yīng)激微環(huán)境中,PEI包被的PLGA納米顆粒對miR21的調(diào)控效果好于lipofectmaine RNAIMAX介導(dǎo)的miR21轉(zhuǎn)染組。
【圖文】：

圖 1 hiPSC 表面標(biāo)志物的免疫熒光染色注：hiPSC 表面標(biāo)志物抗體染色圖（左）；hiPSC 核染色圖（中間）；hiPSC 兩種合圖（右)二、hiMSC 的誘導(dǎo)分化

圖 2 hiMSC 誘導(dǎo)分化及 hBMSC 培養(yǎng)注：a、b 分別為 MSC 誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)第 0 天和第 5 天光鏡照片；c、d、e、f導(dǎo) P、P1、P2、P3 代光鏡照片；g、h、i 分別為 hBMSC P2、P3、P4 代三、hiMSC 細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)鑒定
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2663517