【摘要】：研究背景:腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)在我國老年人群中常見,發(fā)生動脈瘤破裂常致患者猝死。目前對AAA的治療手段主要還是開放手術和介入治療。然而這兩種治療手段均有其相應的局限性,對于老年患者及早期患者均不能完全適用。因此深入探索AAA發(fā)生機制,對于尋找診斷和治療的新靶點,實現(xiàn)早期診斷、早期預防、早期藥物治療,具有重要意義。目前AAA的機制研究已經(jīng)做了大量工作并碩果累累,但目前仍沒有有效的藥物應用于臨床治療。類似于動脈粥樣硬化,慢性炎癥反應是AAA重要機制,肥大細胞(mast cell,MC)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)導致的動脈壁炎癥反應、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解在AAA該過程中起重要作用。文獻提示Meprin-α(Mep1A基因表達)作為金屬內(nèi)肽酶,通過改變蛋白質(zhì)和炎癥因子活性,在動脈粥樣硬化的發(fā)病中扮演著重要角色。主動脈壁中的Meprin A可以分解血管活性肽,也可激活炎性細胞因子促進炎癥,并且最終加速ECM的降解并促進血管重塑。如抑制或敲除Meprin A可能會減弱動脈壁炎癥,抑制主動脈管壁的重塑。在上述研究報道的基礎上,我們推測如將小鼠的MeplA基因敲除,其炎癥反應應該顯著降低,小鼠AAA的形成和進展也將受到抑制。目的:研究Mep1A基因通過炎癥機制在AAA形成和破裂過程中的作用及機制。研究方法:(1)人體標本檢測:收集AAA患者動脈瘤壁組織和正常成人的主動脈壁組織,應用免疫組織化學染色檢測組織標本中Meprin-α的表達是否不同。收集正常人和AAA患者的血清標本,檢測正常人、AAA患者經(jīng)他汀類藥物治療和未經(jīng)他汀類藥物治療等情形下血清炎癥因子,比較其不同;檢測AAA患者經(jīng)他汀類藥物治療前后炎癥因子的變化情況。本步驟揭示Meprin-α和炎癥因子在人體AAA發(fā)病機制中的重要作用。(2)小鼠的培養(yǎng)和AAA模型的建立:使用Apoe-/-Mep1A-/-小鼠及其同窩的Apoe-/-Mep1A+/+小鼠作為實驗對照,實驗前和取材前均測量體重和血壓,通過皮下置入含有血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)微型滲透泵的方法誘導AAA形成。(3)小鼠主動脈組織免疫組織化學分析:應用免疫組織化學染色的方法,對小鼠動脈瘤壁組織和主動脈壁組織中巨噬細胞(Mac-3),T細胞(CD4),肥大細胞(CD117),主要組織相容性復合物-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ),MCP-1,彈力蛋白,CD31,TUNEL和Mep1A,TNF-α等進行免疫染色。通過測量免疫組化染色信號的陽性面積來量化主動脈組織中的巨噬細胞和MCP-1的相對含量。病灶中CD31+的微血管和CD4+T細胞用每平方毫米的數(shù)量來進行定量。將彈力蛋白的降解程度根據(jù)Deckert等報道的分級要點進行分級。(4)實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR):使用Trizol試劑從AAA組織提取總細胞RNA。然后用無RNA酶的DNA酶處理RNA樣品以去除基因組DNA污染物。反轉(zhuǎn)錄等量的RNA,并在單色實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測系統(tǒng)中進行定量PCR。將TNF-α和Mep1 A的mRNA水平標準化為管家基因——GAPDH的mRNA水平。(5)Western Blot分析:主動脈組織或細胞在裂解緩沖液中提取蛋白。將等量的蛋白質(zhì)提取物加載到8%或12%SDS-PAGE凝膠上,轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并用山羊抗兔Mep1 A多克隆抗體,山羊抗兔TNF-α多克隆抗體檢測相應蛋白。同時應用持家蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的進行免疫印跡以確保相等的蛋白質(zhì)加載量。本研究在細胞實驗中也應用Western Blot對IgE刺激MCs后產(chǎn)物中的信號分子進行了檢測。(6)酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA):使用ELISA試劑盒對Apoe-/-Mep1A+/+和Apoe-/-Mep1A-/-小鼠血清及細胞培養(yǎng)上清液中測定血漿中的TNF-α水平。用0.5mmol/L的H2SO4終止反應并在450nm讀取吸光度。使用Graphpad Prism 5.0圖形軟件包計算標準曲線。然后參照標準曲線確定目標基因濃度。(7)細胞培養(yǎng)和小干擾RNA(siRNA)干預:根據(jù)制造商的方案,將培養(yǎng)的肥大細胞應用Mep1A的siRNA進行轉(zhuǎn)染。生長24小時后將粘附80%的細胞徹底洗滌并收獲。研究結果:1.使用免疫組織化學染色在人AAA組織和AngⅡ誘導的小鼠AAA組織中發(fā)現(xiàn)Mep1A的表達增加。2.Ang Ⅱ誘導ApoE-/-小鼠成功的建立了 AAA動物模型。3.Mep1A缺陷提高了 AAA小鼠的存活率。4.病理分析顯示Mep1A的缺失降低了 AAA組織中的彈力層的降解和VSMC凋亡。5.通過rt-PCR,WestemBlot和ELISA等方法,在體外機制研究發(fā)現(xiàn),Mep1A主要在肥大細胞(MCs)中表達,并介導TNF-α的表達。6.MCs分泌的TNF-α促進VSMCs中MMPs的表達,促進VSMC凋亡。7.在人體血清標本中證實,AAA患者血清中Meprin-α和TNF-α也表達增加,而經(jīng)過他汀類藥物短期治療后,炎癥因子TNF-α顯著降低。8.總體來說,本研究發(fā)現(xiàn)Mep1A在肥大細胞中通過分泌TNF-α介導AAA破裂,其促進血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的表達和促進彈性蛋白降解的細胞凋亡。結論:綜合起來,我們的研究數(shù)據(jù)表明Mep1A在MC中表達量調(diào)高,可通過介導MC中TNF-α的分泌,而促進VSMC中MMPs的表達和中層彈力蛋白的降解,以及促進VSMC的凋亡,從而在AAA發(fā)生發(fā)展的病理生理學中發(fā)揮至關重要的作用。敲除Mep1A顯著提高了小鼠AAA的穩(wěn)定性并降低了小鼠死亡率。因此,Mep1A可能成為降低AAA死亡率的新的治療靶點。
【圖文】：

邋ＷＴ）＋鹽水組：Ａｐｏｅ＿Ａ邋ＭｅｐｌＡ＋／＋（邋ＷＴ）小鼠，以鹽水栗進行假手術；②ＷＴ＋ＡｎｇＩＩ逡逑組：Ａｐｏｅｖ＿ＭｅｐｌＡ＋／＋邋（ＷＴ）小鼠，用邋Ａｎｇｌｌ邋處理；③敲除型（ｋｎｏｃｋｏｕｔ，邋ＫＯ）邋＋ＡｎｇＩＩ逡逑組：ＡｐｏｅｉＭｅｐｌＡ－ｚ—邋（Ｋ０）小鼠，用Ａｎｇｌｌ處理。如圖１Ａ和１Ｂ所示，三組動物逡逑標本取材后經(jīng)Ｍｅｐｒｉｎ－ａ免疫組化染色，提示ＭｅｐｌＡ在Ａｎｇｌｌ處理后的ＷＴ小鼠的逡逑血管中高度表達，而在未經(jīng)Ａｎｇｌｌ處理的小鼠和在Ｍｅｐｌ敲除（Ｋ０）小鼠主動脈中逡逑但中表達不高。提示①Ａｎｇｌｌ誘導小鼠主動脈表達ＭｅｐｌＡ增加；②本實驗中ＭｅｐｌＡ逡逑敲除成功。逡逑ＭｅｐｌＡ免疫組化染色逡逑Ａ逡逑，：巧灌衡：：：３逡逑Ａｐｏｅ．ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋邐Ａｐｏｅ＿／＊Ｍｅｐ１邋Ａ＋／＋＋Ａｎｇ邋１１邐Ａｐｏｅ＇ＡＭｅｐ邋１邋Ａ＇Ａ＋Ａｎｇ邋１１逡逑Ｂ邋一一，邐—邐邐—邋ａ邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋逡逑ｇ邋Ｓ邐□邋Ａｐｏｅ＊ＡＭｅｐ１Ａ＋／＋＋Ａｎｇｌｌ逡逑ｃ邋＾邋４－邐￣￣｜邐■邋ＡｐｏｅＡＭ印邋１Ａ．Ａ＋Ａｎｇｌｌ逡逑Ｏ邋＞逡逑＜＾２逡逑－ｒ－逡逑＾逡逑圖１．邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ組織中的表達。（Ａ）邋ＭｅｐｌＡ在小鼠ＡＡＡ組織中的免疫逡逑組織化學。（Ｂ）條形圖顯示小鼠中ＭｅｐｌＡ陽性區(qū)域的百分比。＊示逡逑Ａｐｏｅ－／－ＭｅｐｌＡ＋／＋＋Ａｎｇ邋ＩＩ邋組ＭｅｐｌＡ邋的表達量高于邋Ａｐｏｅ－ＡＭｅｐｌＡ＋／＋組，Ｐ＜０．０５，即邋Ａｎｇｌｌ逡逑刺激主動脈壁邋Ｍｅｐｌ邋Ａ邋表達增加（ｔ＝２．６４２

我們接下來就測試了邋ＭＭＰｓ是否參與了邋ＭｅｐｌＡ介導的ＡＡＡ形成。小鼠主動逡逑脈的免疫組化染色數(shù)據(jù)顯示，，與ＷＴ小鼠相比，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠中ＭＭＰ２和ＭＭＰ９逡逑的表達顯著降低（圖３Ｂ和３Ｃ）。同時，ＲＴ－ＰＣＲ的結果顯示，ＡＡＡ組織中ＭＭＰ２逡逑和ＭＭＰ９的ｍＲＮＡ水平反映了染色結果（圖３Ｄ）。由于細胞凋亡對于血管壁的病逡逑理性重構也是至關重要的，所以我們還檢測了模型小鼠主動脈壁中的細胞凋亡情逡逑況。在我們對小鼠主動脈壁ＴＵＮＥＬ染色的統(tǒng)計中，ＭｅｐｌＡＫＯ小鼠的ＡＡＡ組織中逡逑細胞凋亡的陽性率（２．３５％）顯著低于ＷＴ小鼠（６．８７％）（圖３Ｅ）。這些數(shù)據(jù)表明逡逑ＭｅｐｌＡ缺陷可能通過降低彈性蛋白的降解和細胞凋亡來抑制ＡＡＡ破裂。逡逑３６逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R543.16

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