【摘要】:研究背景動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管系統(tǒng)中最常見的疾病之一,其發(fā)病機制一直是研究的熱點,陸續(xù)出現(xiàn)許多相關學說。近年來,臨床研究提示動脈粥樣硬化的多發(fā)區(qū)域存在共同的血流動力學特點,即血流剪切力改變。正常的生理層流剪切力對血管內皮細胞具有保護作用,促進擴血管活性物質的分泌,抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展;異常的病理剪切力增強血管內皮細胞的氧化應激和炎癥反應,并促進縮血管活性物質和炎性介質的分泌,促進動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展。20世紀90年代,一種新的凋亡相關基因,即程序性細胞死亡因子4(Programmed Cell Death 4,PDCD4)由Shibahara等發(fā)現(xiàn)。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)PDCD4具有調節(jié)多種腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移的作用,并參與多種免疫性、代謝性和炎癥性疾病的過程。既往研究發(fā)現(xiàn)PDCD4與心血管疾病關系密切,促進血管平滑肌細胞凋亡,抑制血管外膜成纖維細胞增殖,增加動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定性,加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,但具體機制尚不清楚。自噬是一種古老的生物學現(xiàn)象,廣泛存在于真核細胞中,也是一種新的程序性細胞死亡形式,通過降解細胞內的代謝廢物并更新細胞器,來維持內環(huán)境平衡。研究發(fā)現(xiàn)自噬與心血管系統(tǒng)關系密切,自噬流的減弱與細胞衰老所致的心肌肥大、心功能降低有關。心肌細胞缺血誘導自噬增強,而增強細胞自噬則能夠有效減輕再灌注所致?lián)p傷。細胞自噬和血流剪切應力,兩者之間存在相互作用,直接或間接影響動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展。但是,病理性震蕩剪切力如何調節(jié)血管內皮細胞自噬,PDCD4是否參與這個過程尚不清楚。炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展多個過程。研究發(fā)現(xiàn)活化的NLRP3炎性小體能夠顯著增加巨噬細胞向泡沫細胞轉化,最終導致動脈粥樣硬化。病理性震蕩剪切力是否影響血管內皮細胞炎性小體的表達,PDCD4是否參與該過程?這些問題尚需明了。目的1.觀察病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞自噬和炎癥小體的影響。2.觀察PDCD4是否介導病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞自噬和炎癥小體的作用。方法1.人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)體外提取和培養(yǎng)確保無菌條件,獲取狀態(tài)良好的長約15-30cm的新生兒臍帶,使用己預熱無菌生理鹽水沖洗管腔,后注入己預熱的胰酶消化液在室溫下消化,吸出胰酶消化液并使用1X PBS溶液,反復沖洗。離心后,棄上清液,加入培養(yǎng)液,混勻細胞,將懸浮液移至無菌培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中,24小時后更換培養(yǎng)液,每隔一天更換培養(yǎng)液。2.體外剪切力干預將I型鼠尾膠原均鋪在高壓滅菌的載玻片上,晾干后,體外培養(yǎng)良好的4-7代HUVECs均勻接種于玻片上,待細胞密度達90%,給予0、1、3、6、9、12、24小時的病理震蕩剪切力(0±4 dyne/cm2大小,頻率為1Hz)刺激。觀察病理性震蕩剪切力對HUVECs中PDCD4表達的影響,并找到適宜的刺激時間,用于后續(xù)的實驗研究。3.細胞轉染細胞轉染的PDCD4 siRNA及陰性對照siRNA均購自上海吉瑪基因生物科技有限公司,具體步驟按照Lipo2000試劑說明書,轉染6-8小時后換液,并進行相應的實驗刺激和檢測。4.蛋白質印跡(Western Blot)利用蛋白提取工作液提取蛋白,行SDS-PAG電泳、轉膜、室溫牛奶封閉、4℃一抗孵育、對應二抗孵育、化學顯影,獲得蛋白條帶灰度值,統(tǒng)計學分析。5.實時熒光定量PCR(RT-PCR)TRIzol法提取HUVECs中總RNA。使用日本TaKaRa試劑盒進行逆轉錄反應,根據(jù)說明書制備反應體系。使用日本TaKaRa的SYBR試劑盒,根據(jù)說明書制備反應體系,行實時熒光定量PCR檢測。6.統(tǒng)計學分析應用SPSS 16.0軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析,平均值±標準誤。非配對t檢驗用于兩組間比較,多樣本分析采用ANOVA單因素的方差分析方法,P0.05認為存在顯著的統(tǒng)計學差異。結果1.病理性震蕩剪切力上調HUVECs中PDCD4的表達與靜止對照組相比,病理性震蕩剪切力干預下,隨著時間的延長PDCD4的蛋白表達水平上調,力學干預6小時至24小時有統(tǒng)計學意義(P0.05);病理性震蕩剪切力干預6和9小時PDCD4 mRNA表達上調有統(tǒng)計學意義(P0.05),并在6小時到達峰值。提示病理性震蕩剪切力可能在轉錄水平上調HUVECs中PDCD4 mRNA,并促進HUVECs中PDCD4蛋白的表達。2.PDCD4參與調節(jié)血管內皮細胞的自噬在靜止條件下,與陰性對照組相比,轉染siRNA后沉默PDCD4,LC3BII/I、ATG5、free ATG12、conj ATG12、P62表達下調(P0.05),ATG3、ATG7、Beclin表達無明顯變化。提示PDCD4參與血管內皮細胞自噬的部分過程的調節(jié)。3.病理性震蕩剪切力參與調節(jié)血管內皮細胞的自噬與靜止對照組相比,力學作用3、6、9小時LC3BII/I表達上調有統(tǒng)計學意義(P0.05)(圖3.A),且6小時到達峰值。給予病理性震蕩剪切力刺激體外培養(yǎng)HUVECs 6小時,通過Western Blot檢測HUVECs中自噬相關分子蛋白表達。實驗結果顯示:在陰性對照組中,與靜止對照相比,病理性震蕩剪切力促進ATG5、free ATG12、conj ATG12、ATG3、ATG7、P62蛋白的表達(P0.05),對Beclin表達無明顯影響。提示病理性震蕩剪切力參與血管內皮細胞自噬的調節(jié)。4.PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞自噬的調節(jié)與陰性對照組相比,沉默PDCD4,能夠阻斷病理性震蕩剪切力對LC3BII/I、ATG5、free ATG12、conj ATG12、P62的促進(P0.05),但對ATG3、ATG7、Beclin的表達無明顯影響(P0.05)。提示PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞自噬調節(jié)的部分過程。5.PDCD4參與血管內皮細胞炎性小體的調節(jié)在靜止條件下,與陰性對照組相比,沉默PDCD4,NLRP3、ASC的mRNA和蛋白均表達下調(P0.05)。提示PDCD4參與血管內皮細胞炎性小體的調節(jié)。6.病理性震蕩剪切力參與血管內皮細胞炎性小體的調節(jié)在陰性對照組細胞中,和靜止對照組相比,病理性震蕩剪切力促進NLRP3、ASC mRNA和蛋白的表達(P0.05)。提示病理性震蕩剪切力促進血管內皮細胞炎性小體表達。7.PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞炎性小體的調節(jié)與陰性對照組相比,沉默PDCD4,能夠阻斷病理性震蕩剪切力對NLRP3、ASC mRNA和蛋白的促進(P0.05)。提示PDCD4參與病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞炎性小體的調節(jié)。結論1.病理性震蕩剪切力調節(jié)血管內皮細胞自噬和炎性小體。2.PDCD4介導病理性震蕩剪切力對血管內皮細胞自噬和炎性小體的作用。
【圖文】:
;邐邋邐邐邐逡逑圖1.實驗技術流程圖逡逑陰性對照組:HUVECs邋中轉染邋siRNA邋Negative邋Control;逡逑PDCD4邋siRNA邋轉染組:HUVECs邋中轉染邋PDCD4邋siRNA;逡逑

-1h邋3h邋6h邋9hOSS邐-邐-邐+邐+逡逑圖3.病理性震蕩剪切力干預下PDCD4對HUVECs中自噬相關分子的影響逡逑A:邋Western邋Blot檢測病理性震蕩剪切力作用Oh、lh、3h、6h、9h、12h后,,逡逑*
【學位授予單位】:山東大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2019
【分類號】:R54
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本文編號:2644824
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