【摘要】：脂滴相關蛋白PLIN2通過促進細胞內脂質蓄積及抑制膽固醇流出而促進泡沫細胞的形成,同時還與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性密切相關,因此在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。有研究表明小分子GTP結合蛋白Rab18與PLIN2共定位于脂滴上,過表達Rab18能使脂滴上PLIN2的數目減少。同時,Rab18過表達還可引起脂滴-內質網的接觸。用RNA干擾或brefeldin A處理降低PLIN2表達后,可引起同樣的形態(tài)學改變。這提示Rab18與PLIN2之間存在著某種聯系,Rab18可能是PLIN2的一個上游調節(jié)基因。本課題組前期研究發(fā)現蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)可與Ox-LDL協同上調PLIN2表達并使細胞內脂滴的蓄積極大地增強。此外,有研究發(fā)現一些PKC亞型的功能與Rab蛋白密切相關。依據這些研究,我們提出“Rab18通過調控PKCα表達,影響PLIN2介導的巨噬細胞內脂質蓄積”的理論假設。在本研究中,我們分別使用動物學及細胞學研究方法,觀察動脈粥樣硬化的ApoE-/-(載脂蛋白E敲除)小鼠主動脈組織中Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達情況,過表達活化型或失活型Rab18對荷脂THP-1巨噬細胞中PKCα、PLIN2表達及脂質蓄積的影響,以及激活或抑制PKCα對過表達Rab18的荷脂THP-1巨噬細胞中PKCα、PLIN2表達及脂質蓄積的影響,探討Rab18對PLIN2介導的巨噬細胞內脂質蓄積的影響及作用機制。在動物實驗中,使用8周齡的ApoE-/-小鼠24只,隨機分為對照組、實驗組(對照組8只,實驗組16只),飼喂12周,其中對照組予以普通飼料,實驗組予以高膽固醇飼料,處死小鼠前從實驗組中隨機分出8只予以禁食48h處理。體視顯微鏡下觀察小鼠主動脈粥樣硬化病變情況,主動脈切片HE染色、油紅O染色、Masson染色觀察小鼠主動脈竇病變情況,Western blot檢測小鼠主動脈組織Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達。在細胞實驗中,(1)Ox-LDL(50 mg/L)處理THP-1巨噬細胞不同時間段(0,6,12,24 h);(2)將野生型Rab18(WT)、顯性突變型Rab18(Q67L)和顯性負性突變型Rab18(S22N)的慢病毒表達質粒通過脂質法轉染THP-1巨噬細胞,Ox-LDL(50 mg/L)處理24 h;(3)將顯性突變型Rab18(Q67L)慢病毒表達質粒轉染THP-1巨噬細胞,Ox-LDL(50 mg/L)處理24 h,然后分別用PKC激動劑PMA(100 nmol/L)和抑制劑Calphostin C(300 nmol/L)處理16 h。采用Western blot檢測細胞內Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達情況,油紅O染色觀察細胞內脂質積蓄情況。研究發(fā)現,(1)動脈粥樣硬化的小鼠主動脈組織內Rab18、PKCα和PLIN2蛋白表達水平較對照組明顯升高,其中禁食48 h小鼠Rab18水平進一步上調,PKCα和PLIN2表達水平較實驗組中未禁食小鼠下降。(2)隨著Ox-LDL處理時間的增加,THP-1巨噬細胞細胞內Rab18、PKCα和PLIN2的蛋白表達增加,其中PKCα和PLIN2表達增加較Rab18出現早,同時在此過程中胞漿內荷脂情況越來越明顯。(3)Rab18(WT)及Rab18(Q67L)轉染組THP-1細胞內PKCα和PLIN2表達明顯降低,細胞內脂質蓄積減少,而Rab18(S22N)轉染組PKCα和PLIN2表達及細胞內脂質蓄積較對照組無明顯差異。(4)100 nmol/L PMA抵消過表達Rab18(Q67L)對PKCα、PLIN2的抑制作用,細胞內脂質蓄積有所增加;300 nmol/L Calphostin C則協同增強過表達Rab18(Q67L)對荷脂THP-1巨噬細胞內PKCα、PLIN2表達的抑制作用,同時進一步減少細胞內脂質積蓄。研究結果,Rab18通過PKCα下調PLIN2表達,從而減少巨噬細胞內脂質蓄積。
【圖文】：

2 章 動脈粥樣硬化的 ApoE-/-小鼠主動脈組織內 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表達升性密切相關，因此我們采用 Masson 染色觀察 Apo-/-小鼠主動脈竇纖維，結果顯示，HF 組和 HF-fasting 組斑塊內膠原纖維含量較 C。

圖 1.2 小鼠主動脈竇斑塊形成情況（×40）注： *P < 0.05，vs. control（n=6）動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織內 Rab18、PKCα 和 PLIN顯上調estern blot 檢測各組小鼠主動脈組織內 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋結果顯示（圖 1.3），與 Control 組相比，HF 組和 HF-fasting 組小鼠 Rab18、PKCα 和 PLIN2 蛋白表達均明顯上調，其中 HF-fasting 平較 HF 組進一步上調，，而 PKCα、PLIN2 蛋白表達則較 HF 組下
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2637643