發(fā)布時(shí)間：2020-04-07 19:49

【摘要】：目的:短鏈�；o酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase,SCAD)是脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶,與心臟能量代謝密切相關(guān)。然而,SCAD在心力衰竭中的變化以及其對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié)作用還不明確。本文通過(guò)建立不同的心力衰竭大鼠模型以及在心力衰竭病人人體水平上探討SCAD的表達(dá)變化,并觀察腺病毒介導(dǎo)SCAD過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死致心力衰竭大鼠的影響,進(jìn)一步明確SCAD在心力衰竭中的作用。方法:1.建立20月齡自發(fā)性高血壓大鼠致慢性心力衰竭模型。通過(guò)超聲心動(dòng)圖、血壓、左室重量指數(shù)、Masson三色染色、DHE染色、透射電鏡評(píng)價(jià)心臟病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變;線粒體JC-1法和線粒體膜腫脹檢測(cè)線粒體功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SCAD及上游信號(hào)分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)變化,檢測(cè)SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析慢性心力衰竭中心肌凋亡的情況,研究SCAD在慢性心力衰竭中的變化及其與心臟能量代謝的關(guān)系。2.采用SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法(Left anterior descending coronary artery ligation,LAD)建立心肌梗死致心力衰竭模型,進(jìn)一步研究SCAD在心肌梗死致心力衰竭中的變化及其與心臟能量代謝的關(guān)系;同時(shí),在運(yùn)動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練的干預(yù)下,研究SCAD在其中的變化趨勢(shì),以確定SCAD在心力衰竭中是否具有積極的保護(hù)作用。通過(guò)超聲心動(dòng)圖、血壓、Masson三色染色、DHE染色、透射電鏡評(píng)價(jià)心臟病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變;線粒體JC-1法和線粒體膜腫脹檢測(cè)線粒體功能;TUNEL凋亡染色,RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SCAD及上游信號(hào)分子PPARα、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評(píng)價(jià)心力衰竭心肌凋亡情況和能量代謝的變化。3.通過(guò)構(gòu)建目的基因SCAD的腺病毒載體,尋找最佳的轉(zhuǎn)染滴度使SCAD在心肌細(xì)胞內(nèi)達(dá)到最佳的表達(dá)豐度。在叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)刺激心肌細(xì)胞建立心肌細(xì)胞凋亡模型前,采用腺病毒介導(dǎo)的SCAD過(guò)表達(dá)進(jìn)行預(yù)處理,通過(guò)RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SCAD的表達(dá)變化,CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖和活力,Hochtest33258/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡,觀察凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞的凋亡情況和能量代謝的變化。4.采用腺病毒多點(diǎn)注射心室壁的方法建立大鼠心肌SCAD過(guò)表達(dá)模型,Western Blot檢測(cè)SCAD在心臟中的表達(dá)變化,確定持續(xù)過(guò)表達(dá)時(shí)間。通過(guò)超聲心動(dòng)圖、血壓、Masson三色染色、DHE染色、TUNEL染色評(píng)價(jià)LAD術(shù)后SCAD過(guò)表達(dá)對(duì)心臟病理學(xué)的影響;RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SCAD、凋亡蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)變化,同時(shí)檢測(cè)SCAD酶活性、ATP含量、心肌和血清游離脂肪酸含量,分析評(píng)價(jià)心肌凋亡情況和能量代謝的變化。5.選取年齡匹配的正常人和心力衰竭病人的心臟切片,采用SCAD免疫熒光法觀察SCAD的變化趨勢(shì),探討人體水平上,SCAD是否也具有相同的變化趨勢(shì),進(jìn)一步確定SCAD作為心力衰竭藥物治療新靶點(diǎn)的可能性,為心力衰竭的臨床治療提供一定的啟示。結(jié)果:1.超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示,20月齡自發(fā)性高血壓大鼠能成功復(fù)制慢性心力衰竭大鼠模型,心力衰竭大鼠的心功能各項(xiàng)指標(biāo)明顯失衡,心力衰竭后期SHR持續(xù)的高血壓狀態(tài)出現(xiàn)顯著降低,可能與心力衰竭心臟的舒縮功能下降有關(guān)。慢性心力衰竭心臟出現(xiàn)明顯的心肌纖維化、心肌凋亡和左室病理重構(gòu),心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)受到明顯損傷,線粒體腫脹,線粒體膜電位下降,活性氧過(guò)度沉積和過(guò)度自噬加速心力衰竭的進(jìn)程。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn),SCAD的表達(dá)在慢性心力衰竭中出現(xiàn)了顯著下調(diào),SCAD酶活性明顯降低,心肌和血清游離脂肪酸大量沉積,ATP含量明顯降低。2.SD大鼠心臟行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)4周后,超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示,大鼠LAD術(shù)后4周成功復(fù)制了心肌梗死后心力衰竭模型,后續(xù)進(jìn)行持續(xù)10周的游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)。單純的LAD大鼠組,心臟病理學(xué)和心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),SCAD及其上游信號(hào)分子PPARα、凋亡因子表達(dá)變化,脂肪酸能量代謝變化與慢性心力衰竭大鼠的結(jié)果趨勢(shì)一致。有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)10周后,心力衰竭游泳組大鼠的心力衰竭進(jìn)程受到明顯的抑制,同時(shí),SCAD及其上游信號(hào)分子PPARα表達(dá)顯著提高,心臟能量代謝障礙得到明顯的改善,心功能明顯提升。3.腺病毒介導(dǎo)的SCAD過(guò)表達(dá)預(yù)處理下,能顯著抑制由tBHP引起的心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí),心肌細(xì)胞的能量代謝障礙得到明顯的改善。4.SD大鼠心臟行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)的同時(shí),進(jìn)行左室壁多點(diǎn)注射腺病毒,腺病毒介導(dǎo)的SCAD在心臟過(guò)表達(dá)能顯著改善由于LAD術(shù)后引起的心力衰竭相關(guān)的心臟病理學(xué)變化和能量代謝障礙。5.SCAD免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn),心力衰竭病人的心臟組織中,SCAD的表達(dá)變化與心力衰竭大鼠的變化趨勢(shì)一致,均呈現(xiàn)負(fù)性調(diào)節(jié)作用。結(jié)論:SCAD與心力衰竭密切相關(guān),并與心力衰竭呈負(fù)性調(diào)節(jié)作用。SCAD作為心臟脂肪酸代謝供能環(huán)節(jié)的關(guān)鍵酶,提高SCAD的表達(dá)能顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡,抑制心力衰竭進(jìn)程,主要原因可能與能量代謝和線粒體凋亡通路的干預(yù)有關(guān),SCAD具有成為心力衰竭藥物治療新靶點(diǎn)的可能性。
【圖文】：

圖 2-1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖比較及參數(shù)的變化Figure2-1 Representative charts of transthoracic M-mode echocardiogram and the changes ofechocardiogram parameters in rats.Compare with WKY group,aP<0.05 ,x±s, n =3．2.5.2 慢性心力衰竭大鼠的血壓變化情況（表 2-1)與 WKY 對(duì)照組相比，SHR 組大鼠的血壓明顯升高(P<0.05)；WKY 對(duì)照組4-9 月齡血壓為 110-120 mmHg，10-20 月齡血壓有所上升并維持在 130-140mmHg(P<0.05)；SHR 組 4-13 月齡血壓有所上升并維持在 200 mmHg 左右，14月齡后血壓下降并維持在 170mmHg(P<0.05)。以上結(jié)果表明，正常大鼠隨著年齡的增長(zhǎng)，血壓有持續(xù)上升的趨勢(shì)；SHR 大鼠在 14 月齡前隨著年齡的增長(zhǎng)，血壓持續(xù)上升，但在 14 月齡后血壓明顯下降(P<0.05)，提示自發(fā)性高血壓大鼠后期轉(zhuǎn)變?yōu)槁孕牧λソ叩倪^(guò)程血壓會(huì)有所降低，可能與心肌泵血能力障礙有關(guān)。

te：Compared with WKY control group，aP<0.01，x±s，n=6.5.4 慢性心力衰竭大鼠的心臟形態(tài)學(xué)檢查（圖 2-2）Masson 染色法結(jié)果顯示，老年 WKY 大鼠無(wú)明顯心肌纖維化；老年腔增大，，膠原沉積明顯增多，心尖部分區(qū)域室壁明顯變薄。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R541.6

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本文編號(hào)：2618315