【摘要】：研究背景:急性冠狀動脈綜合征(ACS)是一種常見的缺血性心臟病急癥,具有高病死率及致殘率。經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)可及時恢復ACS患者冠狀動脈血流灌注,改善心肌缺血,是目前治療ACS最常用方式之一,但ACS患者PCI治療后發(fā)生主要不良心血管事件(MACE)的風險仍然較高。然而,目前尚缺乏用于PCI治療效果監(jiān)測及術(shù)后MACE預測的非侵入性血清學指標。miRNA是長度為19-23個核苷酸的非編碼小RNA,主要在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)靶基因表達。最新研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)miRNA可作為ACS患者診療過程中良好指標。前期研究表明,ACS患者血清miR-186-5p水平顯著升高,且血清miR-186-5p可作為心血管疾病危險分層的分子標志物,提示其作為ACS診斷及預后監(jiān)測循環(huán)標志物的潛能。然而,血清miR-186-5p在ACS患者PCI治療前后水平動態(tài)變化、分布形式、預后價值及miR-186-5p參與心肌缺血缺氧的機制尚待進一步探究。目的:(1)檢測ACS患者PCI治療前后血清miR-186-5p水平動態(tài)變化,分析miR-186-5p在血清中分布形式以及在ACS患者PCI治療中的臨床價值;(2)探尋miR-186-5p在心肌細胞缺血缺氧過程中的作用機制。方法:(1)選取92例ACS患者及96例健康者作為研究對象,收集ACS患者入院即刻、PCI術(shù)后7天內(nèi)以及健康對照禁食12小時以上的血清樣本,采用實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測血清樣本中miR-186-5p水平;采用Life公司外泌體(exosome)提取試劑盒分離exosome及去外泌體上清(exosome-depleted),分別檢測并比較二者中miR-186-5p水平差異;隨訪ACS患者PCI術(shù)后1年內(nèi)MACE發(fā)生情況;通過ROC曲線、Logistic回歸、Spearman相關(guān)性及Cox回歸分析等多種統(tǒng)計學方法分析血清miR-186-5p與ACS患者PCI治療監(jiān)測及預后價值。(2)通過生物信息學軟件預測miR-186-5p靶基因;采取左側(cè)冠狀動脈結(jié)扎術(shù)構(gòu)建SD大鼠心肌梗死(AMI)模型,檢測大鼠血清miR-186-5p水平及心肌組織miR-186-5p及相關(guān)蛋白水平變化;采用Anaeropack厭氧袋結(jié)合無糖無血清培養(yǎng)基構(gòu)建心肌細胞(H9C2)糖氧剝奪(OGD)模型,檢測并分析細胞中miR-186-5p及靶相關(guān)蛋白水平變化,采用熒光素酶報告實驗驗證miR-186-5p與預測基因的靶向關(guān)系,運用蛋白免疫印跡、流式細胞術(shù)及細胞增殖實驗探索與驗證miR-186-5p在心肌細胞急性缺糖缺氧中的潛在的作用機制。結(jié)果:(1)ACS患者(STEMI組,NSTEMI組,UA組)血清miR-186-5p水平較對照組顯著升高(p均0.05),患者組之間水平無明顯差異;ACS患者PCI術(shù)后血清miR-186-5p水平較術(shù)前顯著降低(p均0.05),術(shù)后2天恢復至對照組水平(p0.05);對照組、ACS患者PCI治療前后血清樣本exosome中miR-186-5p水平均顯著低于exosome-depleted中水平(p均0.05),ACS患者PCI治療前后exosome-depleted樣本中miR-186-5p水平變化與總血清miR-186-5p水平變化一致,且二者中miR-186-5p水平均呈正相關(guān)(r=0.238,p0.05),ACS患者、對照組血清exosome中miR-186-5p水平無明顯差異(p均0.05);相關(guān)性分析提示ACS患者血清miR-186-5p水平與HDL-C水平及LVEF呈負相關(guān)(p均0.05),與LDL-C水平、Genisi評分及GRACE評分呈正相關(guān)(p均0.05);ROC曲線分析血清及exosome-depleted中miR-186-5p診斷ACS的曲線下面積分別為為0.70(95%CI:0.62~0.78)和0.81(95%CI:0.70~0.91),多因素Logistic分析表明血清及exosome-depleted中miR-186-5p可作為預測ACS發(fā)生獨立危險因素(OR=1.08,95%CI:1.03~1.14;OR=1.12,95%CI:1.03~1.23);隨訪結(jié)果表明ACS患者PCI術(shù)后1年MACE發(fā)生率為33.7%,發(fā)生MACE的患者術(shù)前血清miR-186-5p水平顯著高于未發(fā)生MACE組患者(p0.05);多因素Cox回歸分析提示血清miR-186-5p可作為ACS患者PCI術(shù)后1年發(fā)生MACE良好預測因子(HR=1.44,95%CI:1.02~2.06)。(2)生物信息學軟件分析提示細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)可能為miR-186-5p靶蛋白;動物實驗中,與假手術(shù)組比較,AMI大鼠血清miR-186-5p水平升高(p均0.05),缺血心肌組織中miR-186-5p水平降低(p均0.05),而ERK1/2、cleaved caspase-3水平升高(p均0.05);細胞實驗中,與對照組比較,OGD組H9C2細胞中miR-186-5p水平升高(p均0.05),細胞外培養(yǎng)基中miR-186-5p水平降低(p均0.05),OGD組細胞ERK1/2、cleaved caspase-3水平升高(p均0.05),過表達或抑制miR-186-5p表達后,ERK1/2與之呈負向水平變化;熒光素酶報告實驗證明miR-186-5p可與ERK1/2 mRNA的3’-UTR靶向結(jié)合;凋亡實驗顯示,OGD處理8小時后H9C2細胞凋亡率顯著增加,OGD處理組及無處理組過表達miR-186-5p后細胞凋亡率均顯著降低(p均0.05);細胞增殖實驗結(jié)果表明,OGD處理8h后H9C2細胞增殖能力下降,OGD處理組及無處理組過表達miR-186-5p后細胞增殖能力均增加(p均0.05)。結(jié)論:ACS患者血清miR-186-5p水平升高,PCI治療后水平下降,血清中miR-186-5p主要以非外泌體形式存在,可能來源于心肌細胞被動釋放,且血清miR-186-5p水平與ACS患者術(shù)后1年內(nèi)MACE發(fā)生具有良好相關(guān)性,心肌細胞中miR-186-5p可通過靶向ERK1/2調(diào)控缺糖缺氧所誘導的細胞凋亡及增殖過程。本研究為miR-186-5p應(yīng)用于ACS患者PCI治療效果監(jiān)測、預后評估及治療等提供了新思路。
【圖文】：

miR-186-5p 作為急性冠脈綜合征標志物的臨床價值及其作用機制研究將 pri-miRNA 在分子基部切割雙鏈形成大小約 70 nt 并能形成莖稱 pre-miRNA，，pre-miRNA5 末端具有磷酸基及多聚腺苷酸酸突出體；然后通過 Ran-GTP 依賴性轉(zhuǎn)運蛋白 Exportin-5 端的二核苷酸突出將其由胞核運輸至胞質(zhì)；隨后，胞質(zhì)中另一種 pre-miRNA 剪切形成不完全配對的 RNA 雙鏈體（miRNA為成熟 miRNA 與其互補序列所組成的二聚體。miRNA：miR選擇性整合到 RNA 誘導沉默復合物（RNA-induced silencing一條未被整合的單鏈 miRNA*可迅速降解，而通常來源于較低NA 更易被整合入 RISC。具體過程如圖 1.1 所示。

miR-186-5p 作為急性冠脈綜合征標志物的臨床價值及其作用機制研究iRNA 及其他多種活性物質(zhì)的 MV 可隨體液循環(huán)達到靶細胞，隨后通過內(nèi)吞結(jié)合等方式進入靶細胞，調(diào)控靶細胞的生物學活動。（3）與 RNA 結(jié)合蛋白合物后被分泌，已知的循環(huán) miRNA 結(jié)合蛋白有高密度脂蛋白（HDL）、ArgonO2）、核磷蛋白 nucleophosmin 1 (NPM1)等，后兩種分泌方式為主動的、耗鏈 RNA 在細胞外環(huán)境中易于被廣泛存在的 RNA 酶降解，但 miRNA 可穩(wěn)定循環(huán)并被檢測，可能存在的保護機制主要有[39,40]：（1）miRNA 被包裹于 MV
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R541.4

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本文編號：2611839