【摘要】：目的:吸煙作為心血管損傷的獨立危險因素嚴重危害人體健康。本實驗通過體外研究尼古丁對血管內皮細胞的影響而模擬在體吸煙對心血管損傷的模型,進而探討尼古丁引起血管內皮細胞的損傷機制,通過明確尼古丁對自噬流及凋亡的影響進而揭示尼古丁與血管內皮細胞功能紊亂之間的關系。方法:用尼古丁干預體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞,模擬在體吸煙模型。1.檢測尼古丁對血管內皮細胞凋亡和自噬的影響,將HUVECs隨機分組:空白對照組、尼古丁組(6×10~(-6) M)/氯喹組(CQ)和氯喹與尼古丁組(CQ+NIC),采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測凋亡相關蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3及自噬小體標志物LC3Ⅱ和自噬相關蛋白Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表達水平;采用流式細胞術檢測血管內皮細胞凋亡率。2.檢測尼古丁抑制自噬的信號通路,將HUVECs隨機分為五組:空白對照組、尼古丁組(15 min、30 min、60 min)、α7nAChR基因沉默組(α7nAChR siRNA+NIC),采用Western Blot方法檢測AMPKα和ERK1/2、JNK、p38 MAPK的磷酸化水平;使用AMPKαsiRNA和ERK1/2/p38 MAPK抑制劑后,采用Western Blot方法檢測SQSTM1/p62、LAMP2的蛋白表達水平。3.檢測ROS是否抑制自噬流自噬小體的清除,將HUVECs隨機分為三組:對照組、尼古丁組(NIC)、α7nAChR基因沉默組(α7nAChR siRNA+NIC)/ROS清除劑組(NAC+NIC),采用流式細胞術檢測細胞內ROS的生成;采用Western Blot方法檢測細胞內SQSTM1/p62、LAMP2蛋白表達水平。結果:1.尼古丁通過增加cleaved caspase-8(外源性凋亡途徑)和cleaved caspase-3的活化及細胞凋亡率,進而促進HUVECs凋亡;尼古丁通過減少Beclin-1和LAMP2、增加LC3Ⅱ、SQSTM1/p62的蛋白表達,進而主要抑制自噬流自噬小體清除,使細胞內自噬流受阻。與空白對照組相比,尼古丁處理后cleaved caspase-9(線粒體凋亡途徑)蛋白表達無統(tǒng)計學差異(P0.05),cleaved caspase-8和cleaved caspase-3蛋白表達都顯著增加(P0.01),細胞凋亡率也與cleaved caspase-3有相同的變化趨勢(P0.01)。與空白對照組相比,自噬小體標志物LC3Ⅱ蛋白表達水平在尼古丁處理后增加(P0.01)。氯喹處理后LC3Ⅱ蛋白表達顯著增加(P0.01),而氯喹預處理后尼古丁引起的細胞內LC3Ⅱ蛋白表達并沒有進一步增加(P0.05);尼古丁組中SQSTM1/p62的蛋白表達與LC3Ⅱ蛋白表達變化相一致(P0.05),而Beclin-1和LAMP2的蛋白表達水平相比對照組降低(P0.05)。2.尼古丁通過α7nAChR(尼古丁血管內皮細胞膜受體)激活AMPKα、ERK1/2/p38 MAPK信號,但信號的活化并不影響尼古丁對自噬流的抑制作用。與對照組相比,AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK在尼古丁處理的各時間點都有磷酸化水平的增加,其中AMPKα在尼古丁干預30 min時磷酸化水平最高(P0.01),而ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平最高則出現(xiàn)在尼古丁干預15 min時(P0.01)。用α7nAChR siRNA處理后,與尼古丁處理30 min或15 min相比,AMPKα、ERK1/2/p38 MAPK磷酸化水平明顯下降,而與對照組相比,JNK在60 min內磷酸化水平無統(tǒng)計學意義(P0.05)。與尼古丁組相比,AMPKα基因沉默時SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表達無明顯變化(P0.05)。此外,p38 MAPK抑制劑SB203580與ERK1/2抑制劑PD98059預處理后SQSTM1/p62和LAMP2蛋白表達水平也無明顯變化(P0.05);而α7nAChR沉默后,SQSTM1/p62和LAMP2的蛋白表達與尼古丁組相反(P0.05)。3.尼古丁通過促進HUVECs內ROS生成,進而抑制自噬流自噬小體的清除。與對照組相比,尼古丁組HUVECs內ROS生成顯著增加(P0.01);沉默α7nAChR后細胞內ROS生成明顯減少(P0.01)。與尼古丁組相比,ROS清除劑(NAC)組SQSTM1/p62蛋白表達水平顯著降低(P0.01),而LAMP2蛋白表達明顯增加(P0.01)。結論:1.尼古丁可通過外源性凋亡途徑而非內源性線粒體凋亡途徑促進HUVECs凋亡,且對自噬有調節(jié)作用,其中自噬小體的生成和降解都受阻,特別是抑制自噬流自噬小體的清除。2.尼古丁通過結合細胞膜α7nAChR增加AMPKα和ERK1/2/p38 MAPK的磷酸化水平,但尼古丁對自噬小體清除的抑制作用并非通過AMPKα和ERK1/2/p38MAPK依賴途徑。3.尼古丁通過促進HUVECs內ROS的過量生成,進而抑制自噬流自噬小體的清除。
【圖文】：

2 結 果2.1 尼古丁增加 HUVECs 凋亡相關蛋白的表達及細胞凋亡率HUVECs 分為空白對照組、尼古丁組，尼古丁干預 24 h 后采用 Western Blot檢測 cleaved caspase-9、cleaved caspase-8 和 cleaved caspase-3 的蛋白表達，采用流式細胞術檢測血管內皮細胞凋亡率。結果如圖 1-1 所示，尼古丁處理后 cleavedcaspase-8 和 cleaved caspase-3 蛋白表達水平相比對照組顯著增加（P<0.01），而cleaved caspase-9 蛋白幾乎沒表達（P>0.05）；圖 1-2 顯示，相比空白對照組，尼古丁干預后血管內皮細胞凋亡率顯著增加（P<0.01），這與凋亡蛋白的檢測結果（圖 1-1）一致，提示尼古丁通過外源性而非內源性線粒體凋亡途徑促進人臍靜脈內皮細胞凋亡。

圖 1-2 尼古丁對人臍靜脈內皮細胞凋亡率的影響（x±s, n＝6）注：與 CON 組相比 **P<0.01.2 尼古丁對自噬的調節(jié)作用HUVECs 分為正常對照組（CON），尼古丁組（NIC），氯喹組（25 mM，CQ喹+尼古丁組（CQ+NIC）。Western Blot 檢測 LC3Ⅱ蛋白表達變化。結果如-3 所示，與正常對照組相比，尼古丁處理組 LC3Ⅱ蛋白表達水平顯著增P<0.01）；氯喹組 LC3Ⅱ蛋白表達也顯著增加，而氯喹預處理尼古丁組 LC3白表達相比氯喹單獨處理組并無明顯改變（P>0.05），，這提示尼古丁作用下內自噬小體大量堆積，自噬流嚴重受阻。與此同時，進一步檢測了自噬相關蛋白 Beclin-1、SQSTM1/p62、LAMP2白表達變化。結果如圖 1-4 所示，與空白對照組相比，尼古丁處理后 Becli
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R54

【參考文獻】

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本文編號：2593740