發(fā)布時(shí)間：2020-02-24 02:25

【摘要】：背景： 尿素通道B（Urea Transporter B, UT-B）是介導(dǎo)尿素快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的膜通道蛋白，在腎臟、心臟、腦等多種組織表達(dá)。前期工作發(fā)現(xiàn)UT-B基因敲除可導(dǎo)致小鼠血清、心臟尿素水平增高，16周齡時(shí)發(fā)生心臟傳導(dǎo)阻滯，在老齡時(shí)左室重構(gòu)、心臟功能下降、間質(zhì)纖維組織增生。左室心肌差異蛋白組學(xué)結(jié)果表明，UT-B基因敲除小鼠糖酵解和脂肪酸β氧化關(guān)鍵酶表達(dá)明顯異常。因此提出UT-B缺失使細(xì)胞內(nèi)尿素堆積導(dǎo)致心肌能量代謝異常，引起心肌肥大的假說。本研究擬觀察UT-B基因敲除小鼠在增齡負(fù)荷（52周齡）及壓力負(fù)荷（16周齡腹主動(dòng)脈縮窄4周）后心臟的形態(tài)學(xué)改變，，與野生型小鼠之間進(jìn)行對(duì)比，探討UT-B基因敲除小鼠對(duì)心肌肥大的易感性，檢測16周和52周UT-B基因敲除小鼠心肌葡萄糖氧化、脂肪酸氧化和糖酵解水平及線粒體功能，與野生型小鼠進(jìn)行差異對(duì)比分析，進(jìn)而驗(yàn)證上述假說，揭示心肌代謝重構(gòu)在UT-B敲除導(dǎo)致小鼠發(fā)生心肌肥大中的作用機(jī)制，尋找防治心肌肥大的新的靶點(diǎn)。 1. UT-B基因敲除小鼠在慢性應(yīng)激負(fù)荷時(shí)更容易發(fā)生心肌肥大 對(duì)52周齡的UT-B基因敲除小鼠的心臟形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行系列研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟重量增加，細(xì)胞直徑增大，間質(zhì)纖維化，發(fā)生明顯心肌肥大。心臟組織MDA水平增加(p0.05)、SOD蛋白表達(dá)和活性下降(p0.05)，ANP表達(dá)增加(p0.05)，電鏡結(jié)果顯示心肌線粒體腫脹、脂滴增加，提示脂肪代謝障礙、氧化應(yīng)激水平增加可能參加其發(fā)病機(jī)制。 對(duì)16周齡和野生型小鼠實(shí)施腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)，結(jié)果表明慢性壓力負(fù)荷時(shí)，UT-B缺失也加速了心肌肥大的進(jìn)程，心肌細(xì)胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平也明顯增加(p0.05)，進(jìn)一步證明UT-B基因敲除后小鼠在慢性負(fù)荷時(shí)容易發(fā)生心肌肥大。 2.16周齡UT-B基因敲除小鼠心肌細(xì)胞糖、脂代謝和線粒體功能的改變 通過PCR array糖代謝芯片檢測UT-B敲除小鼠心肌組織糖酵解關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào)(p0.05)，而部分三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶下調(diào)(p0.05)。Western blot方法檢測糖酵解關(guān)鍵酶烯醇化酶(α-enolase, ENOα)蛋白的表達(dá)明顯增加(p0.05)。熒光探針標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞酸度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H+明顯增加(p0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)UT-B基因敲除小鼠心肌組織中脂肪酸氧化關(guān)鍵酶脂酰輔酶A脫氫酶(acyl-CoA dehydrogenase, ACAD)和重要調(diào)節(jié)因子過氧化物酶體增殖物激活型受體α (peroxisome proliferator activated receptors α, PPARα)表達(dá)水平明顯低于野生型小鼠。以上提示UT-B基因敲除后由于小鼠心肌細(xì)胞尿素轉(zhuǎn)運(yùn)異常，而導(dǎo)致糖、脂代謝異常，可能是心肌肥大易感性增加的主要原因。 應(yīng)用Nanoscale LC MS/MS分析16周UT-B基因敲除小鼠心肌線粒體差異蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50種蛋白發(fā)生明顯調(diào)變，包括線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體I，III，IV和V相關(guān)亞基和清除氧自由基相關(guān)酶隨齡明顯下降(p0.05)；復(fù)合體I和IV活性明顯下降(p0.05)， ATP含量降低(p0.01)，線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)發(fā)生突變。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測UT-B基因敲除小鼠心肌ROS水平和線粒體ΔΨm水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS水平明顯增加(p0.01)，ΔΨm明顯減低(p0.05)。以上結(jié)果說明UT-B基因敲除小鼠線粒體功能明顯異常。 應(yīng)用質(zhì)譜分析16周UT-B基因敲除小鼠心肌L-精氨酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量明顯下降(p0.05)，試劑盒檢測NO含量減少(p0.05)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)、精氨酸酶1（arginase1， Arg1）和精氨酸代琥珀酸合成酶1（Argininosuccinate synthetase1， Ass1）的蛋白表達(dá)明顯下降(p0.05)，結(jié)果說明尿素循環(huán)發(fā)生障礙，可能通過影響尿素循環(huán)對(duì)三羧酸循環(huán)的底物供給而影響三羧酸循環(huán)。 3.52周齡UT-B基因敲除小鼠心肌細(xì)胞糖、脂代謝和線粒體功能的改變 應(yīng)用Nanoscale LC MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，在16周小鼠中發(fā)生調(diào)變的線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體相關(guān)亞基和清除氧自由基相關(guān)酶等在52周UT-B基因敲除小鼠心臟的表達(dá)水平明顯下降(p0.05)；糖代謝關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶b (pyruvatedehydrogenase b, PDHb)明顯增加，異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase2,IDH2）表達(dá)下降(p0.05)，而脂肪酸氧化關(guān)鍵酶ACAD(s)和重要調(diào)節(jié)因子PPARα表達(dá)水平明顯低于野生型小鼠(p0.05)。說明UT-B基因敲除后小鼠心肌細(xì)胞的糖脂代謝異常隨齡持續(xù)存在并加劇，可能為其氧化應(yīng)激水平增加、心肌肥大的主要原因。 綜上所述，UT-B基因敲除小鼠尿素蓄積導(dǎo)致心肌細(xì)胞尿素循環(huán)障礙，繼而導(dǎo)致線粒體三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid, TCA)受阻，能量供應(yīng)減少，線粒體功能障礙，糖、脂底物利用途徑改變，發(fā)生代謝重構(gòu)，氧化應(yīng)激水平增加，促進(jìn)小鼠發(fā)生心肌肥大。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R542.2

【共引文獻(xiàn)】

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1 羅廣平;汪傳喜;夏文杰;葉欣;吐爾洪;王軍;孔慶芳;

本文編號(hào)：2582324