【摘要】：作為心血管疾病的主要危險因素之一，鹽在高血壓的發(fā)病機制和治療方法中起到了顯著作用。在鹽敏感高血壓個體中，鹽負荷過重導致的血壓升高影響了60歲以上的三分之二的高血壓患者。已有學者提出腎臟和中樞神經系統(tǒng)是兩個主要的鹽濃度感受部位，但具體的分子機制尚不清楚。已有模擬鹽敏感高血壓人群的鹽敏感高血壓大鼠模型—Dahl’s大鼠用以研究鹽敏感高血壓的分子水平的機制。 隨著一半以上的高血壓患者為鹽敏感個體，提高對降低鹽敏感性的策略，尤其是在高危人群中，顯得十分必要。據報道，無論是在高血壓個體還是在正常血壓個體，限制鹽的攝入既可降低收縮壓，又可降低舒張壓，而在高血壓個體中血壓下降的幅度更大。然而，基于鹽依賴的對血壓的調節(jié)的分子機制仍有待于完善。目前，除了腎素-血管緊張素系統(tǒng)、血管平滑肌和內皮系統(tǒng)之外，一些內分泌、旁分泌和自分泌系統(tǒng)的因子也開始被重視起來。之前的研究為高鹽降低鹽敏感大鼠的腎臟、背根神經節(jié)和腸系膜動脈TRPV4通道的功能和表達提供了有力的證據。我們以下將探討在鹽敏感高血壓大鼠神經元TRPV4通道表達和功能的變化。 方法： 1.對鹽敏感下丘腦大鼠神經元進行培養(yǎng)； 2.對大鼠下丘腦的神經元、神經膠質細胞進行免疫熒光化學染色，觀察TRPV4在細胞上的存在情況； 3.應用膜片鉗技術觀察TRPV4通道的激動劑、拮抗劑以及高鹽對鹽敏感大鼠神經元動作電位的影響。 4.應用免疫印跡法檢檢測高鹽對大鼠下丘腦TRPV4通道的蛋白表達的影響。 5.應用實時熒光定量PCR技術檢測高鹽對大鼠下丘腦TRPV4通道的mRNA表達的影響。 6.對室旁核腦注射TRPV4通道的激動劑和拮抗劑，評價其對循環(huán)的影響。 實驗結果： 1.免疫熒光染色提示SD大鼠和Dahl’S大鼠下丘腦神經元和神經膠質細胞上存在TRPV4通道提供了證據； 2. GSK使正常鹽溶液和高鹽溶液培養(yǎng)的神經元動作電位均減少：GSK在正常鹽溶液培養(yǎng)的SD大鼠中神經元（NNSSD）和高鹽溶液培養(yǎng)的SD大鼠中神經元（NHSSD）中，其自發(fā)性動作電位的減少無顯著性差異，分別為0.518±0.035、0.382±0.049（P0.05，n=5）。GSK在正常鹽溶液培養(yǎng)的Dahl’S大鼠神經元（NNSDS）和高鹽溶液培養(yǎng)的Dahl’S大鼠神經元（NHSDS）中，其自發(fā)性動作電位的減少存在顯著性差異，分別為0.821±0.042、0.596±0.024（P0.05,n=5）； 3. RuR使正常鹽溶液和高鹽溶液培養(yǎng)的神經元動作電位均增加：RuR在NNSSD和NHSSD中，其自發(fā)性動作電位的減少無顯著性差異，分別為0.671±0.203、0.513±0.100(P0.05,n=5)。RuR在NNSDS和NHSDS中，其自發(fā)性動作電位的減少存在顯著性差異，分別為2.344±0.32、1.667±0.261(P0.05,n=5)； 4.免疫印跡法檢測（Western blot）大鼠下丘腦中TRPV4通道蛋白表達的改變： GAPDH作為內參，我們檢測到一條約100KDa的條帶，即為TRPV4通道蛋白。在下丘腦神經元和PVN組織的TRPV4通道蛋白表達中，我們得到了一致的結果。在神經元組分別為：在神經元的研究中：NNSDS組與NNSSD組相比，NNSDS組蛋白表達顯著高于NNSSD組（0.860±0.251vs0.334±0.224, p0.05,n=5）；NHSDS組與NNSDS組相比，NHSDS組TRPV4蛋白表達明顯低于NNSDS組（0.860±0.251vs0.395±0.251, p0.05, n=5）；而NNSSD組與NHSSD組相比，蛋白含量則無顯著差異（0.334±0.224vs0.295±0.310, p0.05, n=5）。在PVN蛋白組，正常飲食組SD大鼠（SDNS）與高鹽飲食組的SD大鼠（SDHS）蛋白表達無明顯差異，分別為0.444±0.0.056、0.407±0.080(p0.05,n=5)；而在正常飲食組的Dahl’S大鼠（DSNS）與高鹽飲食組的Dahl’S大鼠（DSHS）蛋白表達存在明顯差異，分別為0.615±0.096、0.359±0.043(p0.05,n=5)。 5．在Dahl’S大鼠下丘腦神經元中，NNSDS組TPRV4mRNA表達水平顯著高于NHSDS組（1.862±0.130vs1.152±0.130，n=5, p0.05）；NNSDS組TPRV4mRNA表達水平顯著高于NNSSD(1.862±0.130vs1, n=5, p0.05),說明NNSDS組的TRPV4mRNA表達水平明顯高于NHSDS組，高鹽降低了Dahl’S大鼠下丘腦神經元的TRPV4mRNA的表達，但對SD大鼠下丘腦神經元的TRPV4mRNA的表達沒有影響。在大鼠的PVN組織中TRPV4mRNA表達情況的研究中，我們得到了一致的結果，DSNS組PVN組織中TRPV4mRNA明顯高于DSHS組（3.061±0.186vs0.894±0.150, p0.05, n=5）,說明高鹽飲食降低了Dahl’S大鼠PVN組織中TRPV4mRNA的表達水平；而高鹽飲食對SD大鼠PVN組織中TRPV4mRNA的水平則無顯著影響（1.142vs1， p0.05, n=5）。 6．在PVN中TRPV4通道的活化作用：對大鼠進行GSK PVN微量注射時，與SDNS組(21.3±2.0mmHg)， SDHS組(15.9±2.8mmHg)和DSHS組(26.05±1.4mmHg)相比，DSNS組(50.3±3.6mmHg)血壓下降幅度最大（P0.05，n=5)。GSK腦注射引起心率下降，在DSNS組(126.6±9.6bpm; n=5, P0.05)最為明顯。SDNS組、SDHS組及DSHS組分別為(47.0±3.9bpm),(41.5±2.5bpm)和(75.4±7.8bpm)。 7．在PVN中TRPV4通道的阻斷作用： 將TRPV4拮抗劑RUR100nl（1mmol/L）進行腦注射時，所有組的血壓立即升高，并在在4-5分鐘后達到峰值。RuR的作用持續(xù)約10分鐘。與其他三組相比，DSNS組的血壓變化程度最大(38.8±2.2mmHg，， n=5,P0.05)，SDNS組、SDHS組和DSHS組分別升高為（18.9±2.1mmHg），（14.3±2.1mmHg）和（21.7±2.0mmHg）。心率變化在DSNS組變化最大(143±8.7bpm; n=5, P0.05)，SDNS組、SDHS組及DSHS組分別為（84.8±7.9bpm），（70.5±5.5）和（93.3±6.4bpm）。 結論： 1.TRPV4通道存在于大鼠下丘腦神經元和神經膠質細胞上。 2.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦的TRPV4通道對其激動劑及拮抗劑的反應性下降，而SD大鼠則無顯著改變。 3.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦TRPV4通道的蛋白表達降低，而對SD大鼠無顯著影響。 4.高鹽使Dahl’S大鼠下丘腦TRPV4通道的mRNA表達降低，而對Dahl’S大鼠無顯著影響。 5.高鹽飲食使PVN中TRPV4的活性下降，破壞了TRPV4通道對血壓的調控作用，從而導致了Dahl’S大鼠血壓升高。
【圖文】：

第 3 章 研究結果神經元染色結果 大鼠神經元免疫熒光為了證明 TRPV4 通道存在于神經元和神經膠質細胞上，我們應用了 T的特異性抗體、神經元和神經膠質細胞的特異性抗體 Neun 和 GFAP。（圖 1）：共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經元免疫熒光染色結果：圖下大鼠下丘腦神經元；圖 1B 的紅色部分為神經元的染色結果；圖 1 C分為 TRPV4 通道的染色結果；圖 1D 的黃色部分為 TRPV4 通道和神經位后的合成部分。

共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經膠質細胞免疫熒光染色結鏡下大鼠下丘腦神經膠質細胞；B：紅色部分為神經膠質細：綠色部分為 TRPV4 通道的染色結果；D：黃色部分為 TRP細胞共同定位后的合成部分。鼠神經膠質細胞免疫熒光染色：共聚焦顯微鏡下的大鼠下丘腦神經膠質細胞免疫熒光染色結大鼠下丘腦神經膠質細胞；圖 2B 的紅色部分為神經膠質細胞C 的綠色部分為 TRPV4 通道的染色結果；圖 2D 的黃色部分經膠質細胞共同定位后的合成部分。免疫熒光染色結果為證于大鼠下丘腦神經元和神經膠質細胞提供了直接證據。PV4 激動劑 GSK 對神經元動作電位影響
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R544.1

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本文編號：2545108