本文關(guān)鍵詞：Klotho蛋白改善人EPCs功能、修復(fù)血管損傷的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景和目的血管損傷性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化等易導(dǎo)致心力衰竭、肢體壞死、癱瘓等后果,是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病、多發(fā)病。因此,積極探討損傷血管修復(fù)的研究具有重大科學(xué)意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。血管壁主要由覆蓋血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和中膜的平滑肌細(xì)胞構(gòu)成,是生理?xiàng)l件下保持血管結(jié)構(gòu)功能正常的基本成分。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后可導(dǎo)致粥樣斑塊形成、平滑肌細(xì)胞增殖,是血管損傷性疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理基礎(chǔ)。成熟內(nèi)皮是終末分化細(xì)胞,再生能力有限,針對原位內(nèi)皮的防治策略不能有效修復(fù)損傷性血管。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類可以分化成成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,當(dāng)機(jī)體血管發(fā)生損傷時(shí),EPCs能夠通過遷移、黏附到損傷部位,增殖、分化成內(nèi)皮細(xì)胞,修復(fù)損傷血管,是目前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)與前沿。研究發(fā)現(xiàn)EPCs會(huì)隨著年齡的增長而衰老,具體表現(xiàn)在EPCs結(jié)構(gòu)退行性變、功能減退,數(shù)量減少,血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)能力下降。Klotho蛋白(KL)蛋白是一種內(nèi)源性抗衰老物質(zhì),主要在腎小管上皮表達(dá),有膜結(jié)合型和分泌型兩種異構(gòu)體。Klotho蛋白基因敲除的小鼠骨髓和外周血中EPCs數(shù)量顯著降低,提示Klotho蛋白作為重要抗衰老因素之一可能參與EPCs的功能調(diào)控和血管損傷修復(fù)。本研究擬探討Klotho蛋白對EPCs分化、增殖、遷移、黏附和旁分泌等細(xì)胞功能的影響;并構(gòu)建C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈損傷模型以揭示其能否通過EPCs動(dòng)員、歸巢促進(jìn)血管損傷修復(fù)。方法從健康人外周血中分離并誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs,觀察細(xì)胞形態(tài)并利用其攝取DIL-ac-LDL和特異性結(jié)合UEA-1進(jìn)行鑒定。分別給予0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白刺激,同時(shí)設(shè)置PBS空白對照組、VEGF組(10nmol/L)和Akt信號(hào)通路抑制組(同時(shí)加入10nmol/L Klotho蛋白和1:1000的Akt抑制劑)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度Klotho蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)各組細(xì)胞中CD34+/CD133+和CD31+/v WF+陽性率;Transwell方法檢測各組EPCs的遷移能力;細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的黏附能力;ELISA方法檢測各組EPCs旁分泌SDF-1、b FGF、EGF等細(xì)胞因子變化;Western-blot方法檢測各組EPCs中VEGF和VEGFR-2表達(dá)變化。構(gòu)建C57BL/6小鼠頸動(dòng)脈損傷模型,分別靜脈注射生理鹽水、Klotho蛋白、VEGF、Klotho蛋白+VEGF進(jìn)行干預(yù)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測3d時(shí)Klotho蛋白對頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中EPCs動(dòng)員的影響;同時(shí)ELISA方法檢測Klotho蛋白對頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血中VEGF、SDF-1、EGF、b FGF表達(dá)的影響;測定Klotho蛋白處理頸動(dòng)脈損傷小鼠不同時(shí)期外周血中ET-1和NO含量的變化;利用活細(xì)胞熒光染料CM-DiI和Dio-perchlorate標(biāo)記經(jīng)Klotho蛋白誘導(dǎo)處理的EPCs并通過尾靜脈注射到頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi),3d后取損傷段頸動(dòng)脈,暴露內(nèi)膜面激光共聚焦顯微鏡下觀察檢測各組EPCs的歸巢情況;14d時(shí)利用cy5-CD31標(biāo)記歸巢EPCs分化的內(nèi)皮細(xì)胞,檢測各組頸動(dòng)脈損傷小鼠歸巢EPCs的再內(nèi)皮化情況;HE染色檢測各組頸動(dòng)脈損傷血管內(nèi)膜增生的變化。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)從健康人外周血單核細(xì)胞層中可分離誘導(dǎo)培養(yǎng)得到DIL-ac-LDL攝取和UEA-1結(jié)合雙陽性的EPCs。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白均能夠顯著增加CD34+/CD133+EPCs和CD31+/v WF+內(nèi)皮細(xì)胞的陽性率(vs.對照組,P?0.05);Transwell、細(xì)胞粘附和ELISA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度Klotho蛋白能夠顯著促進(jìn)人EPCs遷移、黏附和細(xì)胞因子SDF-1、EGF、b FGF的旁分泌能力(vs.對照組,P?0.05);同時(shí)Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)0.1、1、10nmol/L Klotho蛋白作用能夠促進(jìn)EPCs中VEGF和VEGFR-2的表達(dá)(vs.對照組,P?0.05);而10nmol/L Klotho蛋白和Akt信號(hào)通路抑制劑Akt inhibitor(1:1000)同時(shí)作用于人EPCs時(shí),CD34+/CD133+EPCs和CD31+/v WF+內(nèi)皮細(xì)胞的陽性率顯著降低,同時(shí)EPCs遷移、黏附和細(xì)胞因子SDF-1、EGF、b FGF的旁分泌能力也隨之顯著降低(vs.10nmol/L Klotho蛋白,P?0.05)。利用導(dǎo)絲損傷建立了C57BL/6頸動(dòng)脈損傷模型后,流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白和VEGF均能顯著增加頸動(dòng)脈損傷小鼠外周血EPCs數(shù)量(vs.對照組,P?0.05);同時(shí)刺激SDF-1、bFGF、EGF、VEGF等因子的分泌(vs.對照組,P?0.05);增加外周血中NO分泌而降低ET-1的表達(dá)(vs.對照組,P?0.05);并能夠顯著增加損傷區(qū)域歸巢EPCs數(shù)量并降低損傷血管內(nèi)膜增生(vs.對照組,P?0.05)。結(jié)論本課題首次直接揭示Klotho蛋白可促進(jìn)人EPCs體外分化、遷移、黏附及旁分泌能力,其機(jī)制可能與促進(jìn)VEGF/VEGFR-2表達(dá)及Akt信號(hào)通路有關(guān)。在體研究發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白能夠促進(jìn)頸動(dòng)脈損傷小鼠體內(nèi)EPCs從骨髓動(dòng)員到外周血,增加VEGF、SDF-1、bFGF、EGF等促血管修復(fù)因子的分泌,顯著提高EPCs歸巢至靶區(qū)域,促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化,抑制新生內(nèi)膜增生,從而修復(fù)損傷血管。
【關(guān)鍵詞】：Klotho蛋白 內(nèi)皮祖細(xì)胞 遷移 黏附 血管損傷 動(dòng)員 歸巢 再內(nèi)皮化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R543
【目錄】：

• 英文縮寫索引4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 Klotho蛋白對人EPCs分化、遷移、黏附、旁分泌的影響12-29
• 2.1 材料和方法12-17
• 2.2 結(jié)果17-26
• 2.3 討論26-28
• 2.4 小結(jié)28-29
• 第三章 Klotho蛋白對頸動(dòng)脈血管損傷修復(fù)的影響29-43
• 3.1 材料和方法30-33
• 3.2 結(jié)果33-40
• 3.3 討論40-42
• 3.4 小結(jié)42-43
• 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-50
• 文獻(xiàn)綜述 Klotho蛋白與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展50-57
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 研究生期間發(fā)表論文57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 余金生,梁擴(kuò)寰,田德安,王天才,唐望先,張文英,劉梅;一氧化氮和內(nèi)皮素對肝硬化大鼠離體內(nèi)臟血管條舒縮的影響[J];中國病理生理雜志;2001年09期

2 袁丹;陳海平;;抗衰老Klotho基因的功能及與人類疾病的關(guān)系[J];中國老年學(xué)雜志;2010年14期

  本文關(guān)鍵詞：Klotho蛋白改善人EPCs功能、修復(fù)血管損傷的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：254005