【摘要】：第一部分PCSK6對(duì)可溶性Corin活化作用的研究研究目的:Corin是一種從心臟中克隆出的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶,其主要功能是將心房利鈉肽前體(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP)轉(zhuǎn)化為有活性的心鈉肽(ANP),從而發(fā)揮排鈉利尿、舒張血管、降低血壓和調(diào)節(jié)心臟功能的作用。在前期研究中,我們及其他課題組研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)與高血壓病發(fā)生相關(guān)的Corin基因突變及多態(tài)性,并證實(shí)這些基因變異影響Corin的功能。還發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者血漿中可溶性Corin水平顯著低于正常人,且降低程度與心衰嚴(yán)重程度相關(guān)。這些結(jié)果說明Corin缺乏或功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致高血壓及心衰等心血管疾病的發(fā)生。同時(shí)還有研究報(bào)道,在小鼠心衰模型研究中發(fā)現(xiàn),過表達(dá)Corin能改善心功能,延長小鼠生存期。提示,補(bǔ)充外源性Corin,提高機(jī)體內(nèi)Corin水平及活性,或許可作為治療心衰的新方法。由于Corin是一個(gè)膜蛋白,不利于大量表達(dá)純化,如能制備分泌型的可溶性Corin將解決這一難題。據(jù)報(bào)道缺失胞內(nèi)段及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)不影響Corin的表達(dá)及活性。這一發(fā)現(xiàn)也使我們研制有活性的可溶性Corin成為可能。同其他Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶一樣,Corin是以酶原形式合成的,需要在其它蛋白酶的活化后才具有功能。因此,Corin的活化是其作為心血管蛋白酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。最近Chen等研究發(fā)現(xiàn)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素6(Proprotein convertase subtilisin/kextin type 6,PCSK6)為Corin的活化酶。然而目前尚不清楚可溶性Corin能否被PCSK6剪切活化,從而使可溶性Corin具有活性。本部分研究中,我們將構(gòu)建可溶性Corin和PCSK6的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,表達(dá)可溶性Corin和PCSK6,并檢測(cè)PCSK6對(duì)可溶性Corin的活化作用。研究方法:1.以野生型Corin質(zhì)粒為模板,利用PCR方法、酶連等方法構(gòu)建出可溶性Corin的表達(dá)載體“p SECsol Corin”及Corin突變體“R801A”和“S985A”。2.將野生型、可溶性Corin及突變Corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人胚胎腎(Human embryonic kidney,HEK)293細(xì)胞,收集培養(yǎng)上清,并制備細(xì)胞裂解液,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)重組Corin蛋白在上清及胞漿內(nèi)的表達(dá)。3.建立HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,分別收集表達(dá)可溶性Corin及PCSK6的細(xì)胞上清,將可溶性Corin上清與不同體積的PCSK6上清孵育,Western blotting檢測(cè)可溶性Corin的活化情況。4.收集pro-ANP上清液,將PCSK6活化的可溶性Corin上清以體積梯度加入pro-ANP上清中并孵育,用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)和Western blotting檢測(cè)的pro-ANP活化情況,從細(xì)胞水平研究可溶性Corin的活化、表達(dá)及生物學(xué)功能。研究結(jié)果:1.我們構(gòu)建了缺失胞內(nèi)段及跨膜區(qū)的可溶性Corin表達(dá)載體。將野生型、可溶性Corin及突變體R801A和S985A分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)Corin蛋白在上清及胞漿內(nèi)的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)胞漿中Corin質(zhì)粒均成功表達(dá),在還原條件下,二硫鍵打開,在野生型Corin及蛋白酶活化位點(diǎn)突變體S985A可檢測(cè)到~40 k Da的還原條帶,而可溶性Corin和活化切割位點(diǎn)突變體R801A則未檢測(cè)到還原條帶。同時(shí),檢測(cè)到可溶性Corin在上清中的表達(dá),相對(duì)分子量約150 k Da。提示我們成功構(gòu)建可溶性Corin表達(dá)載體。2.我們向HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCSK6表達(dá)載體,進(jìn)行篩選,1月后得到6株HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。收集上清,與含可溶性Corin的上清共同孵育,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCSK6可以切割可溶性Corin使其產(chǎn)生~40 k Da的活化條帶,并呈現(xiàn)劑量依賴性。3.我們將已與PCSK6作用過的可溶性Corin加入到pro-ANP上清液中,發(fā)現(xiàn)可溶性Corin具有將pro-ANP活化為ANP的功能,并呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論:我們構(gòu)建了可溶性Corin表達(dá)載體,DNA測(cè)序正確,并能在HEK293中表達(dá)。建立HEK293-PCSK6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)PCSK6可以活化可溶性Corin,活化后的可溶性Corin具有將pro-ANP轉(zhuǎn)化為ANP的功能。本研究為我們進(jìn)一步將可溶性Corin蛋白純化并活化后用于心力衰竭的治療打下重要的基礎(chǔ)。第二部分重組可溶性EKCorin蛋白的表達(dá)、純化及活性研究研究目的:Corin作為一種重要的心血管蛋白酶,具有排鈉利尿、舒張血管、降低血壓和調(diào)節(jié)心臟功能的作用。Corin的缺乏或功能障礙與高血壓及心衰等心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。鑒于目前頑固性心衰的治療方法和效果均十分有限,因此研制具有生物學(xué)活性的可溶性Corin具有重大意義,有望開發(fā)成為新型的抗心衰藥物,造福于廣大心衰患者。第一部分我們研究證實(shí)可溶性Corin可以被PCSK6所活化,活化的Corin也具有生物學(xué)功能。但是,由于工具細(xì)胞HEK293細(xì)胞本身可表達(dá)內(nèi)源性PCSK6,這將自發(fā)的活化部分Corin蛋白,催化其自身降解;另一方面,目前尚無商品化的PCSK6,PCSK6的表達(dá)純化也是實(shí)驗(yàn)的瓶頸。因此為使制備大量的有活性的可溶性Corin蛋白成為可能,我們對(duì)可溶性Corin蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造,在其保守活化位點(diǎn)引入腸激酶(Enterokinase,EK)識(shí)別序列,可以用商品化的EK來活化重組蛋白,實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白活性的特異性調(diào)控。為后期制備大量的具有穩(wěn)定生物學(xué)活性的重組可溶性Corin奠定基礎(chǔ)。研究方法:1.以EKCorin質(zhì)粒(Corin切割活化位點(diǎn)第801位的精氨酸被腸激酶的活化位點(diǎn)取代)為模板,運(yùn)用PCR、連接及轉(zhuǎn)化等分子克隆技術(shù)構(gòu)建帶有EK識(shí)別序列的可溶性Corin表達(dá)載體p SECEKsol Corin。2.將p SECEKsol Corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎293細(xì)胞,用潮霉素(50μg/m L)進(jìn)行篩選,約1月后得到HEK293-EKsol Corin穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,利用Western blotting檢測(cè)可溶性Corin的表達(dá)及蛋白分子量大小,用ELISA方法檢測(cè)可溶性Corin的表達(dá)量。3.收集HEK293-EKsol Corin穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的上清,經(jīng)過鎳柱親和層析分離純化收取目的蛋白,然后利用考馬斯亮藍(lán)染色及Western blotting初步鑒定蛋白純度及分子量大小,BCA法測(cè)定蛋白濃度。4.用濃度梯度的EK活化重組蛋白EKsol Corin。5.通過pro-ANP活化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化蛋白的生物學(xué)活性。研究結(jié)果:1.成功構(gòu)建帶有EK識(shí)別序列的可溶性Corin表達(dá)載體p SECEKsol Corin。2.獲得150株EKsol Corin穩(wěn)定細(xì)胞系,最終篩選出25株表達(dá)量大于0.1μg/m L的細(xì)胞株。3.鎳柱親和層析得到的純化蛋白,純度約為70%。4.EK作用后的EKsol Corin蛋白具有活化pro-ANP的功能。結(jié)論:我們構(gòu)建了帶有EK識(shí)別序列的可溶性Corin表達(dá)載體,DNA測(cè)序正確,并能在HEK293中表達(dá),建立了高表達(dá)EKsol Corin的穩(wěn)定細(xì)胞系。利用鎳柱親和層析純化得到目的蛋白EKsol Corin,并用EK剪切活化,得到具有活性的可溶性Corin。本研究證實(shí),可溶性Corin可在體外表達(dá)并被EK活化,活化后的Corin具有生物學(xué)活性,本研究為后期制備大量的有活性的可溶性Corin用于心衰模型小鼠的治療奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.6

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1 李楓;可溶性Corin的表達(dá)、純化及功能研究[D];蘇州大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：2506745