發(fā)布時(shí)間：2019-03-25 11:46

【摘要】：目的:肺動(dòng)脈高壓是一種復(fù)雜的小肺動(dòng)脈疾病,以持續(xù)性血管收縮,血管壁的增厚,血管改建和進(jìn)展性肺動(dòng)脈阻力的增加為特征,其病情發(fā)展可導(dǎo)致右心衰竭并最終導(dǎo)致死亡。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的異常增殖被認(rèn)為是血管壁增厚,血管改建,動(dòng)脈管腔狹窄的主要原因。最近的動(dòng)物和人的實(shí)驗(yàn)研究均表明,除了缺氧外,吸煙可能對(duì)血管結(jié)構(gòu)的變化產(chǎn)生直接的作用,致使發(fā)生肺動(dòng)脈的改建進(jìn)而發(fā)展為肺動(dòng)脈高壓。然而,這其中準(zhǔn)確的機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞內(nèi)鈣離子在調(diào)節(jié)血管平滑肌中扮演著重要的作用。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加可以激活收縮蛋白,并引起收縮反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加主要依賴肌漿網(wǎng)(SR),電壓門控鈣通道(voltage-operated calcium channels,VOCC),和鈣庫(kù)操作性鈣通道(store-operated calcium channel,SOCC)。近年來(lái),SOCC 在血管平滑肌領(lǐng)域獲得了極大的研究注意。SOCC是一種高度選擇性的鈣通道,其組分構(gòu)成尚不完全清楚,且因細(xì)胞種類不同而異,目前已發(fā)現(xiàn)包括基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule,STIM)家族、Orai、一過(guò)性受體電位非選擇性陽(yáng)離子通道(transient receptor potential non-selective cation channel,TRPC)家族。TRPC 是SOCC的重要組成部分,可以被G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體活化,是一種非選擇性、Ca2+滲透性陽(yáng)離子通道,有證明表明好幾種TRPC通道充當(dāng)SOCC的組成,然而,大部分證據(jù)都依賴于特定TRPC亞型的敲除或者siRNA的轉(zhuǎn)染沉默,而非直接證明其在SOCC的功能。一個(gè)重要的研究發(fā)現(xiàn)是,特定亞型的TRPC的敲除可引起同等程度的SOCC活動(dòng)和鈣內(nèi)流的抑制。一般來(lái)說(shuō),TRPC1,4和5對(duì)鈣庫(kù)的耗竭敏感,是SOCC的組成部分,TRPC3,6和7組成受體操作性鈣通道(receptor-operated channels,ROCs),為 G 蛋白激酶 C 和甘油二酯提供門控。STIM家族主要包括兩種亞型,STIM1和STIM2,有實(shí)驗(yàn)證明在HEK293細(xì)胞,STIM1被siRNA轉(zhuǎn)染后的表達(dá)下調(diào)可抑制毒胡蘿卜素引起的鈣內(nèi)流和毒蕈堿刺激誘導(dǎo)的鈣電流,但是不改變剩余鈣離子水平,膜電位。而STIM2的抑制則沒有STIM1明顯。STIM1氨基端的信號(hào)肽序列和跨膜部分表明蛋白的氨基端對(duì)應(yīng)著細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)和ER的管腔,所以STIM1可能充當(dāng)鈣離子感受器的作用,引起SOCE的活動(dòng)。STIM1以介導(dǎo)非興奮細(xì)胞的鈣觸發(fā)鈣釋放電流而作為其主要功能,同時(shí),STIM1也被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上充當(dāng)感受器。在PASMC,SOCC主要由表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子感受器STIM1與表達(dá)于細(xì)胞膜的非選擇性蛋白TRPC1是SOCC的重要組成部分。通過(guò)SOCC形成的操作性鈣內(nèi)流(store-operated calcium entry,SOCE),近年來(lái)獲得了極大地研究關(guān)注。盡管SOCE被發(fā)現(xiàn)已有20年,但SOCC的構(gòu)成和功能一直存在爭(zhēng)議。SOCE是一種重要的細(xì)胞程序,與許多細(xì)胞活動(dòng)相關(guān),如增殖、遷移、收縮等。之前有許多研究證明,不同類型的細(xì)胞內(nèi)SOCE的阻斷可抑制細(xì)胞增殖,而細(xì)胞增殖則與SOCE的增強(qiáng)有關(guān)。SOCE形成的典型細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如下:當(dāng)胞內(nèi)尤其是肌質(zhì)網(wǎng)儲(chǔ)存的Ca2+的耗竭時(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白即鈣離子感受器STIM1聚集成簇并脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合位點(diǎn),朝細(xì)胞膜移動(dòng),將成孔蛋白TRPC1活化,并形成STIM1—TRPC1復(fù)合體,導(dǎo)致Ca2+通道開放,進(jìn)而形成SOCE。SOCE在PASMCs的增殖和遷移中扮演重要角色,SOCE的阻滯劑如Ni2+、SKF96365能明顯減緩PASMC的增殖。細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)是cyclin家族中的重要成員,是細(xì)胞增殖程序重要的調(diào)節(jié)物質(zhì),在細(xì)胞增殖過(guò)程,cyclin D1可作為絲分裂的感受器,同時(shí)也能通過(guò)驅(qū)動(dòng)目的細(xì)胞度過(guò)G1期以促進(jìn)細(xì)胞增殖。作為一種協(xié)作癌基因,cyclin D1基因在惡性腫瘤患者頻繁過(guò)表達(dá),并且在腫瘤的發(fā)展、維持中起著十分重要的作用。有模型表示cyclin D1的過(guò)表達(dá)在細(xì)胞周期調(diào)控途徑中可能充當(dāng)驅(qū)動(dòng)癌基因的角色。腫瘤生長(zhǎng)階段,可較早發(fā)現(xiàn)cyclin D1表達(dá)過(guò)剩。且近來(lái)越來(lái)越多的報(bào)道指出,cyclin D1是與肺動(dòng)脈高壓相關(guān)的重要的下游媒介,可通過(guò)促進(jìn)PASMCs增殖的方式參與肺動(dòng)脈血管的重塑�；谝陨献C據(jù),我們假設(shè)吸煙促進(jìn)PASMCs增殖的機(jī)制為:吸煙誘導(dǎo)PASMC的SOCC表達(dá)的上調(diào)(SOCE的增強(qiáng)),接著SOCE的增強(qiáng)引起下游的cyclin D1表達(dá)增加來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)將就此假設(shè)研究吸煙引起細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法:第一部分:研究CSE對(duì)HPASMCs增殖的影響。對(duì)HPASMCs分別進(jìn)行0(對(duì)照組),0.5%,1%,2%,3%,5%,10%濃度的CSE處理,24小時(shí)后觀察HPASMCs的增殖情況。第二部分:研究CSE處理后細(xì)胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,以及鈣離子濃度。根據(jù)第一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將HPASMCs分成4組即0(對(duì)照組)、0.5%CSE組、11%CS組、33%CS組,并分別應(yīng)應(yīng)用western blot和RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞的STIM1,TRPC1和cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,為更直觀地觀察各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,使用鈣探針對(duì)各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)行檢測(cè)。第三部分:研究SOCC與cyclin D1的關(guān)系。對(duì)HPASMCs進(jìn)行siRNA(TRPC1)轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染,再對(duì)兩類HPASMCs各4組的細(xì)胞增殖情況和cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:第一部分:0.5%,1%CSE組對(duì)HPASMCs有促進(jìn)增殖作用(P0.05),且0.5%CSE組促進(jìn)作用更加明顯(P0.05),而3%及以上濃度的CSE對(duì)HPASMCs反而有抑制作用(P0.05)。第二部分:與對(duì)照組相比,0.5%,1%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平,以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度都有升高(P0.05)。而3%CSE組的STIM1,TRPC1,cyclin D1的mRNA和蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度則出現(xiàn)下降(P0.05)。第三部分:siRNA(TRPC1)轉(zhuǎn)染組的HPASMCs增殖和cyclinD1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較陰性對(duì)照組降低(P0.05)。結(jié)論:第一部分:低濃度的CSE可以促進(jìn)HPASMCs增殖,而高濃度的CSE則抑制HPASMCs 增殖。第二部分:CSE通過(guò)SOCE的增強(qiáng)(SOCC的上調(diào))以促進(jìn)HPASMCs增殖。第三部分:CSE通過(guò)(至少是部分)SOCC的介導(dǎo)的cyclin D1表達(dá)通路誘導(dǎo)HPASMCs 增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

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本文編號(hào)：2446943