【摘要】：一、研究背景近年來,經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)已經(jīng)廣泛的用于治療血管壁粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄。然而,有相當(dāng)一部分患者術(shù)后發(fā)生病變處血管的再狹窄,從而降低了PCI的療效,并且增加再發(fā)心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)。目前認(rèn)為損傷血管修復(fù)過程中,新生內(nèi)膜的異常增生是發(fā)生PCI術(shù)后再狹窄的病理生理基礎(chǔ)。而血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力的增強(qiáng),是血管損傷后新生內(nèi)膜增生,從而導(dǎo)致管腔狹窄的重要原因。而血管平滑肌細(xì)胞具有顯著的表觀可塑性,使其可快速適應(yīng)周圍環(huán)境的改變。當(dāng)受到細(xì)胞外基質(zhì)成分、細(xì)胞因子、剪切力、氧自由基等因素的刺激后,血管平滑肌細(xì)胞會(huì)顯著降低血管平滑肌細(xì)胞分化標(biāo)志物的表達(dá),提高增殖,遷移和合成的細(xì)胞外基質(zhì)的能力,以參與新生內(nèi)膜的形成。血管平滑肌細(xì)胞表型的開關(guān)在血管疾病中發(fā)揮重要的作用,因此,認(rèn)識(shí)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制,有可能為防治PCI術(shù)后再狹窄提供調(diào)控的靶點(diǎn)。OCT4由Pou5fl基因編碼產(chǎn)生,主要定位于細(xì)胞核,其在胚胎干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等未/低分化細(xì)胞高表達(dá),而在高度分化的成體細(xì)胞正常情況下則幾乎不表達(dá)。近年來,隨著對(duì)OCT4研究的深入,發(fā)現(xiàn)OCT4除了在干細(xì)胞和生殖細(xì)胞腫瘤中高表達(dá)以外,還在非生殖系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞中同樣有表達(dá)。不僅如此,OCT4甚至在成體細(xì)胞和異位的子宮內(nèi)膜組織中再表達(dá),并且使腫瘤細(xì)胞和成體細(xì)胞表現(xiàn)出易于遷移和增殖的表型。這些研究結(jié)果提示,OCT4極可能在某些病理狀態(tài)下被激活,從而在細(xì)胞去分化的過程中起到重要的作用,并使得細(xì)胞表現(xiàn)出更容易增殖、遷移等具有去分化表型的能力。目前,在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制研究中,關(guān)于OCT4的作用鮮有報(bào)道。本課題旨在通過在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察OCT4對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用,以及對(duì)下游靶基因的調(diào)控機(jī)制。二、研究目的1、刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,檢測(cè)OCT4的表達(dá),并通過過表達(dá)和抑制的方法觀察OCT4對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移的影響;2、在小鼠頸動(dòng)脈損傷模型上觀察OCT4對(duì)血管新生內(nèi)膜增殖的調(diào)節(jié)；3、用生物學(xué)方法檢測(cè)與OCT4可能相互作用的靶基因,明確其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞功能的調(diào)控作用。三、研究方法(一)第一部分用腫瘤壞死因子-α,白介素-1-β,血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞,用定量PCR和western blot的方法檢測(cè)OCT4的表達(dá)情況。在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)和抑制OCT4,用CCK-8、平板劃線,transwell實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)OCT4在血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用。(二)第二部分建立小鼠頸總動(dòng)脈損傷模型,小鼠隨機(jī)分為以下幾組：1、頸動(dòng)脈損傷組；2、頸動(dòng)脈損傷+OCT4腺病毒轉(zhuǎn)染組；3、頸動(dòng)脈損傷+GFP腺病毒轉(zhuǎn)染組；4、頸動(dòng)脈損傷+siRNAocT4轉(zhuǎn)染組；5、頸動(dòng)脈損傷+siRNACTRL轉(zhuǎn)染組,對(duì)側(cè)血管作為Sham對(duì)照。分別在損傷后3天,7天,14天處死老鼠,做組織切片HE染色,免疫組化,定量PCR等,并測(cè)量小鼠內(nèi)膜和中膜的面積,計(jì)算內(nèi)膜／中膜比值。在小鼠損傷血管中,對(duì)OCT4的表達(dá)做定位和定量分析。在小鼠損傷血管過表達(dá)和抑制OCT4的表達(dá),用組織切片HE染色,定量PCR等實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)OCT4在血管新生內(nèi)膜形成中的作用。(三)第三部分在血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)OCT4,用定量PCR的方法用篩選在血管平滑肌細(xì)胞中可能受到OCT4調(diào)控的靶基因。選擇下游基因進(jìn)行細(xì)胞功能測(cè)試。四、研究結(jié)果(一)第一部分血管平滑肌細(xì)胞中OCT4的mRNA水平在白介素-1-β,腫瘤壞死因子-α,PDGF-BB,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p刺激下,發(fā)生不同程度的改變。PDGF-BB刺激血管平滑肌細(xì)胞,誘導(dǎo)OCT4表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性。在血管平滑肌細(xì)胞過表達(dá)OCT4,平板劃線和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Ad-OCT4的血管平滑肌細(xì)胞遷移數(shù)量較轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細(xì)胞多,CCK-8結(jié)果提示轉(zhuǎn)染Ad-OCT4的血管平滑肌細(xì)胞增殖的數(shù)量較轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細(xì)胞多。siRNA轉(zhuǎn)染PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染siRNAOCT4的血管平滑肌細(xì)胞遷移數(shù)量較轉(zhuǎn)染siRNACTRL時(shí)細(xì)胞少,CCK-8結(jié)果提示轉(zhuǎn)染siRNAOCT4的血管平滑肌細(xì)胞增殖的數(shù)量較轉(zhuǎn)染siRNACTRL的細(xì)胞少。(二)第二部分1、在小鼠頸動(dòng)脈損傷后14天的頸動(dòng)脈橫切片上,經(jīng)免疫熒光雙標(biāo)染色顯示OCT4表達(dá)在新生內(nèi)膜血管平滑肌細(xì)胞中,且為核表達(dá)。OCT4特異性抗體對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組化染色顯示OCT4在損傷后第7天在新生內(nèi)膜有表達(dá),14天在內(nèi)膜的表達(dá)較第7天顯著增加,提示OCT4的表達(dá)隨損傷時(shí)間而增多。損傷血管的OCT4的mRNA水平較未損傷的對(duì)照組升高(P0.05)。2、轉(zhuǎn)染Ad-OCT4腺病毒組,損傷的小鼠頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜面積(32.45±1.82)×103μm2明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(21.48±0.75)×103μm2 (P0.05)。轉(zhuǎn)染Ad-OCT4腺病毒組新生內(nèi)膜/中膜的比值(1.03±0.07)明顯大于感染Ad-GFP腺病毒組(0.74±0.06;P0.05)。3、未損傷組的小鼠血管內(nèi)彈力板完整,管壁光滑,無內(nèi)膜增生;siRNA oCT4或者siRNACTRL。siRNACTRL轉(zhuǎn)染損傷的小鼠頸動(dòng)脈組可見中膜內(nèi)排列紊亂的平滑肌細(xì)胞,血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核明顯增大變圓,損傷血管內(nèi)膜可見彌漫性增厚,伴有明顯管腔的縮小。而轉(zhuǎn)染siRNAOCT4組盡管也可見中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂,但損傷血管內(nèi)膜彌漫性增厚的程度較前者較輕,且管腔的縮小明顯較輕。血管內(nèi)膜面積(4.95±1.54)×103μm2明顯小于siRNAcTRL組(23.53±2.18)×103μm2(P0.05)。新生內(nèi)膜/中膜比值也明顯小于siRNACTRL組(0.19±0.06 VS 0.89±0.14; P0.05)。(三)第三部分1、在過表達(dá)OCT4的血管平滑肌細(xì)胞中,表達(dá)升高達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因有：Sox2, Nanog, BMP4, Etv5, Etv1, Foxd3, KLF4, KLF5, Gadd45a, MMP2, MMP9;表達(dá)下降達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因有：TCF3, Vegfc, DUSP27, Tns3, Psme4。2、MMP2在過表達(dá)OCT4的血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞中,RNA水平和蛋白水平均顯著升高。siRNAMMP2轉(zhuǎn)染組血管平滑肌細(xì)胞的增殖較對(duì)照組降低但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,轉(zhuǎn)染了siRNAMMP2以后,穿過劃線的平滑肌細(xì)胞較對(duì)照組的數(shù)量顯著降低,穿過小室的平滑肌細(xì)胞也較對(duì)照組的數(shù)量顯著降低。五、結(jié)論1.不同刺激因子使血管平滑肌細(xì)胞的OCT4的表達(dá)發(fā)生變化。OCT4促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。抑制OCT4表達(dá)可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。2.OCT4在小鼠頸動(dòng)脈損傷模型中升高,主要在新生內(nèi)膜的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。過表達(dá)OCT4促進(jìn)小鼠頸動(dòng)脈損傷的新生內(nèi)膜的增生。下調(diào)OCT4抑制小鼠頸動(dòng)脈損傷的新生內(nèi)膜的增生。3.OCT4調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞,是通過對(duì)一些基因的調(diào)節(jié)。MMP2作為OCT4的下游基因,參與了OCT4調(diào)控的血管平滑肌細(xì)胞的遷移,可能影響細(xì)胞增殖。4.OCT4可能作為冠心病,支架植入術(shù)后再狹窄等血管增殖性疾病新的治療方向,為臨床的應(yīng)用提供的新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54

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本文編號(hào)：2439803