【摘要】：由于當(dāng)今社會人們生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的變化,心血管系統(tǒng)疾病如缺血性心臟病,心肌梗死,擴張型心肌病,心臟衰竭等的發(fā)病也呈逐年上升趨勢,威脅著人類健康。目前心肌梗死等疾病主要依靠溶栓、抗心力衰竭以及抗心律失常等治療方法。對于擴張型心肌病的治療則沒有特效藥物及方法,主要是針對心力衰竭等相關(guān)癥狀對癥治療�，F(xiàn)有的研究也證實,中醫(yī)藥治療心肌梗死等缺血性心臟病,在一定程度上緩解患者的臨床癥狀且副作用小,但是單純的中藥治療仍不能短時間內(nèi)補充受損的心肌細(xì)胞,無法從根本達(dá)到治愈患者的目的。對于心血管系統(tǒng)疾病晚期的患者,心臟移植是唯一的有效治療手段。因此研究者和臨床工作者們?nèi)耘ふ沂挂呀?jīng)壞死的心肌組織及細(xì)胞修復(fù)或再生的新的治療方案,基于此,干細(xì)胞移植便成為了國內(nèi)外心血管系統(tǒng)疾病研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mensenchymal stem cells,BMSCs)是一種分化能力較強的細(xì)胞,且具有多向分化的潛能和較強的可塑性。在特定組織微環(huán)境作用下可以定向分化為相應(yīng)組織所需的成熟細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等,也能分化為心肌細(xì)胞。目前大多數(shù)研究者采用的使BMSCs定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)劑是5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)。臨床上常用的治療心血管疾病的中藥作為誘導(dǎo)劑也逐漸成為人們關(guān)注的對象。丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)是從中藥丹參中提取的有效成分。研究表明,丹參酮ⅡA在誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖和分化過程中顯示出巨大的潛力。本研究探討5-氮胞苷聯(lián)合丹參酮ⅡA對BMSCs定向分化為心肌細(xì)胞的影響。首先分離并采集SD大鼠四肢骨骨髓,培養(yǎng)BMSCs,取第2代細(xì)胞生長48h后分為以下四組進(jìn)行誘導(dǎo):(1)加入含丹參酮ⅡA(終濃度為500ng/ml)的培養(yǎng)基,3天后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基,加入不含有丹參酮ⅡA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(2)加入含5-氮胞苷(終濃度為250μg/L)的培養(yǎng)基,3天以后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基,加入不含有5-氮胞苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(3)加入含丹參酮ⅡA和5-氮胞苷(終濃度分別為500ng/ml和250μg/L)的培養(yǎng)基,3天后去除誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基,加入不含有丹參酮ⅡA和5-氮胞苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4W。(4)對照組加入不含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng),3天以后換液。此后定期換液(1次/3天),每天觀察細(xì)胞,當(dāng)發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞融合達(dá)約90%的密度時用0.04%的EDTA和0.5%的胰酶(1:1)消化,隨后以1:2的密度接種傳代。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)蛋白、橫紋肌肌動蛋白(a-SCA-actin)和心肌特異性肌鈣蛋白T(cTnT)的表達(dá)情況。免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)檢測聯(lián)合誘導(dǎo)組a-SCA-actin、cTnT的表達(dá)。結(jié)果表明5-氮胞苷誘導(dǎo)組7d時細(xì)胞以梭形、多邊形為主,丹參酮ⅡA誘導(dǎo)組培養(yǎng)10d時細(xì)胞逐漸呈長梭形,排列緊密,方向一致。二者聯(lián)合誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑后28d的BMSCs呈長圓柱狀,排列更加緊密,方向一致。未加誘導(dǎo)劑的BMSCs則呈纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變。免疫細(xì)胞化學(xué)觀察在各誘導(dǎo)組cTnT、desmin、a-SCA-actin均為陽性表達(dá),細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色,而對照組各標(biāo)記物呈弱陽性或陰性表達(dá),誘導(dǎo)各組與對照組各標(biāo)記物的陽性表達(dá)均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,聯(lián)合誘導(dǎo)組a-SCA-actin陽性表達(dá)為紅色,cTnT陽性表達(dá)為綠色,兩者重疊部位為黃色,呈現(xiàn)共表達(dá)。透射電鏡結(jié)果顯示,聯(lián)合誘導(dǎo)組細(xì)胞可見平行排列的肌絲并富含線粒體、糖原和核糖體以及豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。結(jié)果顯示:1.BMSCs可以通過TanshinoneⅡA單獨誘導(dǎo)、5-aza單獨誘導(dǎo)以及TanshinoneⅡA聯(lián)合5-aza共同誘導(dǎo)等方式成功分化為心肌細(xì)胞。2.通過對各實驗組分化細(xì)胞的desmin、α-actin、cTnT的表達(dá)情況以及形態(tài)學(xué)觀察對比,觀察到5-aza聯(lián)合TanshinoneⅡA共同誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的陽性率明顯高于5-aza和TanshinoneⅡA分別單獨誘導(dǎo)分化的陽性率,5-aza和TanshinoneⅡA聯(lián)合誘導(dǎo)的方式更加高效。
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【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 屈佳;高東來;;體外模擬心肌環(huán)境誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年08期

2 孔曉丹 ,曲鵬 ,王彥 ,李玲 ,富晶;三七皂甙誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的實驗研究[J];中國心血管病研究雜志;2005年07期

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本文編號：2387231