【摘要】：目的通過研究重型再生障礙性貧血(Severe aplastic animia,SAA)患者髓系樹突狀細胞(myeloid dendritic cell,m DC)內(nèi)丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2,PKM2)表達水平,及其對m DC和下游效應(yīng)T細胞的影響,在細胞和分子水平上探討PKM2控制m DC的過度免疫反應(yīng)、維持免疫穩(wěn)態(tài)及調(diào)控SAA自身免疫狀態(tài)的機制。通過SAA小鼠模型分析不同免疫抑制劑對PKM2和m DC細胞功能的影響,為研究細胞代謝在機體免疫中的作用提供新的思路,并為開展針對髓系樹突狀細胞的靶向治療研究提供理論依據(jù)。方法實驗對象選取天津醫(yī)科大學總醫(yī)院自2014年4月至2016年10月收入院的初治SAA患者、經(jīng)免疫抑制治療后緩解的SAA患者,以及健康志愿者。SAA小鼠模型選用C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠的子一代CB6F1作為受鼠(品系編碼:303,8周齡,SPF級),C57BL/6小鼠作為淋巴細胞供鼠。所有小鼠均采購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所動物中心代為飼養(yǎng)。第一部分檢測SAA患者體內(nèi)PKM2水平。選取15例SAA初治患者、15例SAA恢復期患者、及26名正常對照,采用流式細胞儀(FACS)、q RT-PCR及Western技術(shù)檢測SAA患者外周血及骨髓m DC細胞內(nèi)PKM2蛋白及m RNA的表達水平,并與正常人對比。同期檢測上述SAA患者中性粒細胞計數(shù)、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)、T亞群比值,及m DC細胞數(shù)量、功能、活化因子表達,將PKM2水平與之進行相關(guān)性分析。第二部分觀察PKM2對SAA患者m DC細胞增殖、活化的影響。應(yīng)用RNAi敲低SAA患者m DC細胞內(nèi)的PKM2后,流式細胞術(shù)檢測敲低前后m DC細胞共刺激分子CD80、CD86表達水平,使用熒光免疫微球檢測m DC細胞攝取能力,掃描電子顯微鏡下觀察m DC細胞形態(tài)的變化。第三部分觀察PKM2對SAA患者m DC細胞激活CTL(CD8+T細胞)的影響。應(yīng)用RNAi敲低SAA患者m DC細胞內(nèi)的PKM2表達后,將m DC細胞與CD8+T細胞共培養(yǎng),實時定量PCR技術(shù)檢測CTL細胞穿孔素、顆粒酶m RNA表達水平,ELISA試劑盒檢測混合培養(yǎng)上清IFN-γ濃度,流式細胞術(shù)檢測CTL細胞凋亡水平。第四部分SAA小鼠模型分析PKM2對m DC細胞功能的影響。構(gòu)建SAA小鼠模型,流式細胞術(shù)檢測CD4+/CD8+比值、Treg比例;CTL細胞功能分子穿孔素、顆粒酶水平;m DC細胞的數(shù)量、活化因子表達、PKM2表達水平。使用環(huán)孢素A和FK506對AA小鼠進行給藥干預,檢測用藥前后各組m DC細胞數(shù)量、活化因子表達、PKM2水平及對CTL激活作用;檢測m DC細胞內(nèi)葡萄糖消耗量、丙酮酸、ATP生成水平。結(jié)果第一部分流式細胞術(shù)檢測初治組SAA患者m DC細胞內(nèi)的PKM2水平(59.1±15.8)%高于緩解組(42.6±22.1)%和正常對照組(32.7±20.2)%。且PKM2表達水平與DC細胞比例呈正相關(guān)(=0.476;=0.0145),而與網(wǎng)織紅細胞比例(=-0.209;=0.0305)、中性粒細胞絕對值(=-0.258;=0.0122)和T亞群比值(=-0.397;=0.0013)呈負相關(guān)。初治SAA患者m DC細胞內(nèi)PKM2 m RNA表達水平(1.50±0.84)明顯高于緩解組(0.81±0.24)和對照組(0.32±0.11)。Western技術(shù)檢測初治組患者m DC細胞內(nèi)PKM2蛋白水平也明顯升高。而經(jīng)過免疫抑制治療后,m DC細胞內(nèi)PKM2無論是基因水平還是蛋白水平都逐漸下降趨近于正常。第二部分掃描電子顯微鏡下觀察可見,對照組SAA患者的m DC胞體較大,細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞膜表面可見樹突狀或毛刺狀的突起,突起數(shù)量較多且粗長。當PKM2-si RNA轉(zhuǎn)染SAA患者的m DC后,細胞胞體表面變得光滑,趨于圓形,細胞膜向外伸出的樹突回縮,數(shù)量減少,且樹突細短。通過流式細胞術(shù)檢測敲低組m DC細胞吞噬百分率(36.68±5.49)%顯著低于對照組(44.31±4.83)%,相較于對照組,敲低組吞噬指數(shù)存在較明顯的降低趨勢。在敲低m DC內(nèi)PKM2表達后,SAA患者m DC細胞內(nèi)CD86的表達水平(41.89±5.54)%較敲低前(55.76±7.08)%明顯減低(P0.05),CD80的表達水平有減低趨勢。相關(guān)性分析顯示SAA患者m DC內(nèi)PKM2表達水平與CD86細胞比例呈明顯正相關(guān)(=0.562;=0.0126),而與CD80表達水平無顯著相關(guān)性(=0.054;0.05)。第三部分實時定量PCR技術(shù)檢測PKM2-si RNA敲低組SAA患者CD8+T細胞內(nèi)穿孔素m RNA表達水平(0.84±0.39)明顯低于對照組(1.23±0.43),而顆粒酶m RNA的表達水平在PKM2-si RNA組與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義。ELISA試劑盒檢測混合培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn),PKM2-si RNA敲低組SAA患者m DC細胞與CD8+T細胞混合培養(yǎng)上清IFN-γ濃度(134.2±25.1)pg/ml明顯低于對照組(466.3±53.9)pg/ml。此外,相較于對照組(34.86±11.05)%,PKM2-si RNA組中CTL細胞的凋亡水平(51.12±14.96)%出現(xiàn)顯著升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第四部分成功構(gòu)建小鼠SAA模型,流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Treg比例下降,CD4+/CD8+比值降低,CTL細胞功能分子穿孔素、顆粒酶表達增加;m DC細胞的共刺激分子因子CD86表達增加,m DC細胞內(nèi)PKM2水平升高,且m DC細胞內(nèi)PKM2水平與m DC和T細胞功能具有明顯相關(guān)性。使用環(huán)孢素和FK506作為免疫抑制劑對AA小鼠進行干預后,小鼠外周血象逐漸恢復,m DC細胞和CD8+T細胞功能分子水平下降,m DC細胞內(nèi)PKM2表達水平明顯降低。m DC細胞內(nèi)葡萄糖、丙酮酸、ATP生成水平較治療前下降(P0.05)。結(jié)論1、初治SAA患者m DC細胞內(nèi)PKM2蛋白和m RNA水平均明顯過度表達,經(jīng)過強化免疫抑制治療(IST)可得到明顯改善。m DC內(nèi)PKM2水平與DC細胞水平呈正相關(guān),與網(wǎng)織紅細胞、ANC和T細胞亞群呈負相關(guān)。表明PKM2可能參與了SAA患者體內(nèi)m DC細胞的活化過程,并且與疾病進展程度呈現(xiàn)相關(guān)性。2、使用RNAi技術(shù)敲低SAA患者m DC內(nèi)PKM2表達后,m DC細胞樹突數(shù)量減少,抗原攝取能力受損,共刺激分子CD80、CD86的表達降低,表明PKM2具備刺激m DC細胞增殖、活化的能力。3、PKM2能夠通過m DC激活下游CTL細胞功能,使CTL功能分子表達水平升高,功能亢進,進而增強對靶細胞的殺傷作用。4、成功建立SAA小鼠模型,在動物實驗中證實了PKM2對m DC細胞和T細胞的激活作用。SAA小鼠m DC細胞內(nèi)的高PKM2表達促進了細胞的糖酵解代謝水平,為m DC細胞及下游T細胞增殖和活化創(chuàng)造了物質(zhì)和能量條件,當使用免疫抑制劑后,m DC細胞糖酵解代謝水平出現(xiàn)整體下降趨勢。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R556.5

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本文編號：2373933