【摘要】：第一部分硫化氫通過(guò)抑制NLRP3/IL-1β通路改善自發(fā)性高血壓大鼠腎動(dòng)脈內(nèi)皮功能目的:原發(fā)性高血壓往往伴有內(nèi)皮功能紊亂,可能與體內(nèi)氧化應(yīng)激和免疫機(jī)制紊亂有關(guān),氧化應(yīng)激狀態(tài)下NLRP3炎癥小體被激活,而其下游的促炎因子IL-1β能夠直接破壞血管內(nèi)皮功能。繼一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)被發(fā)現(xiàn)之后,硫化氫(H_2S)作為第三類氣體信號(hào)分子而被發(fā)現(xiàn),其具有改善血管內(nèi)皮功能紊亂等多種心血管保護(hù)作用,但是作用機(jī)制不甚清楚。本部分研究利用SHR高血壓模型,在體和離體給予Na SH,以探討H_2S對(duì)NLRP3/IL-1β通路和血管內(nèi)皮功能的影響。方法:1實(shí)驗(yàn)分組:在體實(shí)驗(yàn)分為四組,分別為京都Wistar大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)組,WKY+硫氫化鈉(Na SH)組,自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)組,SHR+Na SH組。其中Na SH組動(dòng)物從8周齡開始,每日腹腔注射給予Na SH 100μmol/kg,至24周齡結(jié)束。離體實(shí)驗(yàn)分為五組,選取24周齡實(shí)驗(yàn)大鼠,分別為1)WKY組2)SHR組3)SHR+H_2S(100μmol/L)組4)SHR+LPS(10μg/ml)組5)SHR+LPS+H_2S組。2利用鼠尾動(dòng)脈測(cè)壓系統(tǒng)測(cè)量每組動(dòng)物的鼠尾動(dòng)脈收縮壓(Systolic blood pressure,SBP),從8周測(cè)量至24周,每?jī)芍軠y(cè)量一次。3在體實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物滿24周后取其兩側(cè)腎臟內(nèi)微動(dòng)脈二級(jí)分支,行微血管環(huán)張力測(cè)定,測(cè)定其內(nèi)皮依賴的舒張功能和內(nèi)皮依賴的收縮功能。離體實(shí)驗(yàn)無(wú)菌分離兩側(cè)腎臟內(nèi)微動(dòng)脈二級(jí)分支,放入培養(yǎng)箱中離體孵育16小時(shí)后,行微血管環(huán)張力測(cè)定,測(cè)定其內(nèi)皮依賴的舒張功能和內(nèi)皮依賴的收縮功能。4通過(guò)Western blot技術(shù)測(cè)定腎臟微動(dòng)脈內(nèi)H_2S生成酶CSE,氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf2,NOX4,P67phox,SOD,CAT,和IL-1β通路蛋白NLRP3,Caspase-1和IL-1β的表達(dá)。5取24周動(dòng)物血漿,液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)量血漿H_2S水平;化學(xué)法測(cè)定血漿丙二醛(MDA)含量;ELISA法測(cè)定血漿IL-1β含量。結(jié)果:1在慢性給藥結(jié)束時(shí),SHR組動(dòng)物的鼠尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)明顯高于WKY組,給予Na SH后可以明顯降低SHR的血壓,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而對(duì)WKY血壓幾乎無(wú)影響。2 SHR血漿H_2S水平和CSE水平明顯降低于WKY組,而給予Na SH后H_2S補(bǔ)充了高血壓動(dòng)物內(nèi)源性硫化氫的不足,上調(diào)了CSE酶表達(dá),使H_2S水平增加。3 SHR組腎動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿(Ach)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴舒張反應(yīng)性較WKY組明顯下降,而內(nèi)皮依賴的收縮反應(yīng)顯著增強(qiáng)。外源性給予Na SH可以顯著改善內(nèi)皮依賴性舒張功能,抑制過(guò)強(qiáng)的內(nèi)皮依賴收縮反應(yīng)。離體孵育H_2S可顯著改善SHR大鼠受損的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能,抑制其內(nèi)皮依賴性收縮功能,而給予LPS激活NLRP3通路后H_2S的這種保護(hù)作用被取消。4 SHR腎動(dòng)脈內(nèi)的氧化應(yīng)激蛋白NOX,P67phox水平升高,而抗氧化蛋白Nrf2,SOD,CAT表達(dá)下降,慢性給予Na SH可以明顯下調(diào)氧化蛋白的表達(dá)和上調(diào)抗氧化蛋白的表達(dá)。此外,慢性給予Na SH降低了SHR血漿中氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛(MDA)的水平。而體外急性給予LPS激活NLRP3通路后H_2S的這種抗氧化趨勢(shì)被取消。5 SHR腎動(dòng)脈內(nèi)的NLRP3/caspase-1/IL-1β通路蛋白表達(dá)明顯增高,慢性給予Na HS可明顯下調(diào)上述炎癥通路的表達(dá)。另外,慢性給予Na SH降低了SHR血漿IL-1β水平。體外孵育實(shí)驗(yàn)給予LPS過(guò)度激活SHR體內(nèi)的NLRP3通路后,上述蛋白未見明顯增加,而再給予Na SH發(fā)現(xiàn)其對(duì)炎癥蛋白的下調(diào)作用消失。結(jié)論:外源性給予H_2S可增強(qiáng)SHR內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能,抑制其過(guò)強(qiáng)的內(nèi)皮依賴的收縮功能,進(jìn)而降低SHR血壓。H_2S這種改善內(nèi)皮功能的作用可能是通過(guò)抑制NLRP3炎癥通路,及阻斷其與氧化應(yīng)激之間的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。第二部分硫化氫通過(guò)上調(diào)Nrf2蛋白增強(qiáng)抗氧化能力發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用目的:核因子紅細(xì)胞-2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2-related actor 2,Nrf2)最初認(rèn)為與紅細(xì)胞的分化和發(fā)育有關(guān),越來(lái)越多的研究認(rèn)為其與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。Nrf2是核因子轉(zhuǎn)錄家族的成員,在一般情況下處于抑制狀態(tài),與分子伴侶Keap-1結(jié)合,當(dāng)細(xì)胞受到氧化刺激時(shí),轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和立刻從Keap1上解離下來(lái)并進(jìn)入細(xì)胞核,隨后與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,啟動(dòng)抗氧化基因,促進(jìn)下游抗氧化蛋白的合成。本部分實(shí)驗(yàn)旨在討論H_2S的內(nèi)皮保護(hù)作用是否可以通過(guò)上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)內(nèi)的Nrf2蛋白表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力而實(shí)現(xiàn)。方法:1應(yīng)用CCK-8法測(cè)定HUVECs活性預(yù)先半小時(shí)向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同梯度濃度H_2S(0μmol/L,50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L),AngⅡ1Μm/L刺激6h后觀察HUVECs活性的變化。2 HUVECs用慢病毒基因敲除Nrf2,并分為六組:1)陰性對(duì)照(Negative control,NC)組2)NC+血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)1μmol/L組3)NC+ AngⅡ 1μmol/L+H_2S 100μmol/L 組4)Nrf2敲除(Small interferce RNA,si RNA)組5)Si RNA+ AngⅡ 1μmol/L 組6)Si RNA+ AngⅡ 1μmol/L+H_2S 100μmol/L 組活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平使用DHE染色法測(cè)定。Nrf2,SOD,CAT,NOX4,P67phox,NLRP3,Caspase-1,IL-1β的表達(dá)經(jīng)過(guò)Western blot法測(cè)定。結(jié)果:1 AngⅡ可明顯降低HUVEC活性,而H_2S可以提高HUVECs的生物活性,并且呈劑量依賴性。2 DHE染色發(fā)現(xiàn)AngⅡ能明顯增加ROS水平,H_2S可顯著降低ROS水平�；蚯贸齆rf2后ROS水平明顯增加,且H_2S降低ROS的作用被減弱。3與NC組相比,NC+AngⅡ組和三個(gè)Si RNA基因敲除組的Nrf2蛋白表達(dá)降低,氧化蛋白NOX4,P67phox表達(dá)增加,抗氧化蛋白SOD,CAT表達(dá)量減少,在NC組給予H_2S后可以上調(diào)Nrf2,SOD和CAT的表達(dá),降低氧化蛋白NOX4,P67phox的表達(dá),而在Nrf2被敲除后再給予H_2S則這種逆轉(zhuǎn)作用被消除。4與NC組相比,NC+AngⅡ組和三個(gè)Si RNA基因敲除組的NLRP3,Caspase-1,IL-1β表達(dá)量增加,在NC組給予H_2S后可以下調(diào)上述蛋白表達(dá),而在Nrf2被敲除后再給予H_2S這種下調(diào)作用消失。結(jié)論:H_2S通過(guò)提高Nrf2的表達(dá),增強(qiáng)抗氧化蛋白的表達(dá),降低氧化應(yīng)激,從而抑制其下游的炎癥因子表達(dá),提高內(nèi)皮細(xì)胞活性,來(lái)發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞和抗高血壓的作用。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R544.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 齊洪娜;崔潔;劉磊;盧飛飛;宋成潔;石s，

本文編號(hào)：2254320