發(fā)布時(shí)間：2018-10-05 10:35

【摘要】：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)使管腔狹窄或阻塞,導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球疾病狀況評(píng)估報(bào)告顯示,過去十年因缺血性心臟病死亡的人數(shù)占人類疾病死亡總數(shù)的48.6%,位居首位。盡管目前通過及時(shí)有效PCI手術(shù)或者溶栓療法可以減少心梗面積并且改善臨床預(yù)后,但是這種再灌注療法在改善缺血心肌血流供給的同時(shí)會(huì)帶來另一種損傷,稱之為心臟缺血再灌注損傷。心臟缺血再灌注損傷的病理機(jī)制,主要認(rèn)為與心肌鈣離子超載、活性氧的大量釋放、細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡的波動(dòng)以及炎癥反應(yīng)作用有關(guān),但是心臟缺血再灌注損傷的機(jī)制還需要進(jìn)一步闡述。心臟缺血再灌注損傷通常分為四種類型:第一種為心肌細(xì)胞的頓抑,一種心肌在經(jīng)過短時(shí)缺血后恢復(fù)血液供應(yīng),心肌出現(xiàn)持續(xù)數(shù)天至數(shù)周的功能障礙,這一損傷通�？赡娌⑶易罱K冠脈血流可以恢復(fù)正常。心肌頓抑與心臟能量代謝障礙密切相關(guān);第二種為無復(fù)流現(xiàn)象,主要是由于心臟微循環(huán)在結(jié)構(gòu)或功能上的變化,使得灌注缺血區(qū)域的冠脈沒有血液供給;第三種為再灌注導(dǎo)致的心律失常;第四種為致死性再灌注損傷。溶血磷脂酰膽堿是一類含磷的類脂化合物,機(jī)體內(nèi)溶血磷脂酰膽堿主要來源于細(xì)胞膜的磷脂雙分子以及載脂蛋白表面的磷脂酰膽堿,在磷脂酶A1的作用下磷脂酰膽堿甘油主鏈第一個(gè)碳原子的脂肪酸被水解生成2-酰基-溶血磷脂酰膽堿,而磷脂酶A2則水解甘油主鏈第二個(gè)碳原子生成1-�；�-溶血磷脂酰膽堿。心臟缺血再灌注損傷可以造成細(xì)胞膜上的磷脂酰膽堿的降解,激活的磷脂酶A2使得脂肪酸在細(xì)胞膜上的積累,不飽和脂肪酸花生四烯酸被認(rèn)為可以促進(jìn)再灌注階段的炎癥反應(yīng),而其他的脂肪酸具有緩解心臟缺血再灌注損傷的作用。另一方面,溶血磷脂酰膽堿可以引起心肌細(xì)胞鈣離子超載而影響大鼠心臟的機(jī)械與代謝活動(dòng),因此被認(rèn)為與心律失常相關(guān)。許多刺激包括細(xì)胞內(nèi)外的氧化還原反應(yīng)都可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在心臟缺血再灌注損傷中心肌缺血區(qū)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的表達(dá)顯著高于缺血邊緣區(qū)和邊緣遠(yuǎn)區(qū)。過表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1信號(hào)通路下游分子XBP1后,GRP78明顯升高,心梗面積出現(xiàn)明顯下降,這說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路在保護(hù)心臟缺血再灌注損傷中起到重要作用。既往研究報(bào)道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以增強(qiáng)磷脂酶iPLA2β的活性,并且在抑制iPLA2β的活性后可以顯著減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡的作用。因此,我們提出這一假設(shè):在心臟缺血再灌注損傷中溶血磷脂酰膽堿的升高一方面可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的升高對(duì)心臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用;另一方面溶血磷脂酰膽堿的升高可以引起鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),可能是造成心臟缺血再灌注損傷無復(fù)流的一個(gè)重要因素。第一部分體外心肌缺血再灌注損傷中溶血磷脂酰膽堿表達(dá)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的變化目的:觀察在缺血再灌注損傷中心肌的死亡以及細(xì)胞形態(tài)變化,同時(shí)檢測(cè)缺血再灌注損傷后細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外溶血磷脂酰膽堿濃度的變化。觀察在缺血再灌注損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活情況,檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中重要分子伴侶GRP78以及GRP94的表達(dá)與分布。方法與結(jié)果:通過構(gòu)建體外心肌缺血再灌注模型模擬缺血再灌注損傷,從缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間上控制變量,乳鼠心肌經(jīng)過3個(gè)小時(shí)的缺氧和過夜再灌注處理后,可以造成近40%的細(xì)胞死亡是常氧對(duì)照組細(xì)胞死亡的4倍(P0.001);而經(jīng)過6個(gè)小時(shí)缺氧與過夜再灌注處理的細(xì)胞可以造成78%的細(xì)胞死亡,與常氧對(duì)照組相比上升了近6倍(P0.001)。采用BD公司Calibur流式檢測(cè)經(jīng)缺氧6小時(shí)和再灌注過夜后的心肌細(xì)胞,與常氧組相比可以觀察到明顯的細(xì)胞形態(tài)的改變。通過溶血磷脂酰膽堿高效液相色譜法檢測(cè)試劑盒測(cè)定溶血磷脂酰膽堿,可以觀察到經(jīng)過缺氧后細(xì)胞內(nèi)溶血磷脂酰膽堿的濃度明顯上升,而細(xì)胞上清中溶血磷脂酰膽堿的濃度也顯著升高(P0.001)。除此之外,心肌缺血再灌注損傷可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路,分子伴侶GRP78與GRP94的表達(dá)上調(diào),并且分子伴侶GRP78在細(xì)胞膜上的分布也顯著增加。結(jié)論:體外心肌缺血再灌注損傷中可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外溶血磷脂酰膽堿表達(dá)并且激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路。第二部分溶血磷脂酰膽堿和分子伴侶GRP78對(duì)心臟缺血再灌注損傷的調(diào)控作用目的:為了明確溶血磷脂酰膽堿對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用,觀察外源性溶血磷脂酰膽堿對(duì)分子伴侶GRP78的表達(dá)的影響。為了明確GRP78對(duì)于心臟缺血再灌注損傷的作用,構(gòu)建心肌特異性過表達(dá)GRP78轉(zhuǎn)基因小鼠以及敲除GRP78的小鼠,觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78對(duì)于心臟缺血再灌注的保護(hù)作用以及具體的機(jī)制。方法與結(jié)果:實(shí)驗(yàn)中分別給予乳鼠心肌細(xì)胞0～80μM溶血磷脂酰膽堿,12個(gè)小時(shí)后60μM～80μM的溶血磷脂酰膽堿明顯上調(diào)分子伴侶GRP78的表達(dá)。構(gòu)建αMHC-Cre和CAG-loxP-STOP-loxP-GRP78雙陽性的在心肌細(xì)胞中特異性過表達(dá)GRP78蛋白小鼠,并將單陽性或者野生型的小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。所有的小鼠都給予結(jié)扎前降支45分鐘,再灌注24小時(shí)的缺血再灌注處理。分離心臟組織并用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)進(jìn)行染色,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比在心肌細(xì)胞過表達(dá)GRP78可以降低缺血再灌注后的心梗面積(p0.05),降低心梗后纖維化的程度,并且過表達(dá)GRP78可以激活A(yù)kt信號(hào)通路。構(gòu)建αMHC-mER-Cre-mER和GRP78flox/flox小鼠,在小鼠第12周齡時(shí)給予腹腔注射他莫昔芬10mg/kg連續(xù)5天,剪切基因組中GRP78序列進(jìn)而在心肌中特異性敲除GRP78蛋白。在注射他莫昔芬第十二天后敲除GRP78的小鼠縮短分?jǐn)?shù)(FractionShortening,FS)明顯下降并引起小鼠死亡。結(jié)論:溶血磷脂酰膽堿可以上調(diào)乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶GRP78的表達(dá),過表達(dá)GRP78的小鼠可以減少缺血再灌注后心梗面積和降低纖維化程度,這可能與Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。條件性誘導(dǎo)敲除GRP78以后小鼠心臟功能下降并引起小鼠死亡。第三部分外源性溶血磷脂酰膽堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制的研究目的:觀察溶血磷脂酰膽堿誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎癥因子白介素-8的情況,進(jìn)一步檢測(cè)NF-κB以及類泛素化修飾在炎癥調(diào)控中的作用并且評(píng)估了內(nèi)皮細(xì)胞釋放白介素-8對(duì)單核細(xì)胞的粘附作用。方法和結(jié)果:溶血磷脂酰膽堿溶解在PBS中,分別給予內(nèi)皮細(xì)胞40、60和80μM溶血磷脂酰膽堿的濃度梯度。經(jīng)過3個(gè)小時(shí)的作用,內(nèi)皮細(xì)胞上清中白介素-8的釋放隨著溶血磷脂酰膽堿處理濃度的升高而升高,內(nèi)皮細(xì)胞核區(qū)域出現(xiàn)了 p65亞基的轉(zhuǎn)位。除此之外,經(jīng)過溶血磷脂酰膽堿處理后內(nèi)皮細(xì)胞-162IL-8啟動(dòng)子序列熒光素酶的活性顯著上升(P0.001),而AP-1和NF-κB序列突變的熒光素酶的活性沒有顯著改變。另一方面,在敲低Ubc9和HDAC4后溶血磷脂酰膽堿對(duì)白介素-8的上調(diào)作用明顯減弱,在敲低Ubc9后溶血磷脂膽堿對(duì)于IκB蛋白降解作用明顯延遲。最后溶血磷脂酰膽堿可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞THP-1的粘附作用,而使用白介素-8抗體后內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附作用顯著減輕。結(jié)論:溶血磷脂酰膽堿可以通過增加類泛素化作用激活NF-κB通路上調(diào)白介素-8的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R541.4

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本文編號(hào)：2253060