【摘要】：研究背景及目的眾多研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)晚期巨噬細(xì)胞的凋亡造成As斑塊形態(tài)學(xué)改變(尤其是帽/核比值的變小),影響斑塊易損性,從而造成斑塊不穩(wěn)定,是導(dǎo)致各種心血管疾病的重要原因。As斑塊中的巨噬細(xì)胞幾乎都變成了泡沫細(xì)胞,巨噬細(xì)胞/泡沫細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞外脂質(zhì)核的發(fā)生和擴(kuò)大,在脂質(zhì)核的非細(xì)胞部分可發(fā)現(xiàn)凋亡殘留體[1-3]。誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,對(duì)通過(guò)巨噬細(xì)胞凋亡建立As易損斑塊模型進(jìn)而了解As易損斑塊發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。鑒于以往的眾多研究已得出的結(jié)論,即巨噬細(xì)胞凋亡和斑塊破裂的關(guān)系,從這層關(guān)系出發(fā),如果能成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,那么就可以采取同樣的方法誘導(dǎo)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡來(lái)建立動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊模型,從而建立一個(gè)體外可控可量化的斑塊破裂模型,方法簡(jiǎn)單易行。因此,我們嘗試一種方法來(lái)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,為后期建立類似于人類As病變的易損斑塊模型提供依據(jù)。大腸桿菌嘌呤核苷酸磷酸化酶(E.coli purine nucleoside phosphorylase,ePNP)基因有較強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用,因此一直是基因治療的熱點(diǎn)[1]。ePNP作為一種前藥轉(zhuǎn)換酶基因,能將某些腺嘌呤類似物,如fludarabine等轉(zhuǎn)化成高毒性能自由穿透細(xì)胞膜的代謝產(chǎn)物,從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起細(xì)胞死亡[4、5]。眾多研究已經(jīng)在肝癌,胰腺癌等腫瘤細(xì)胞中證實(shí)ePNP自殺基因系統(tǒng)良好的殺傷細(xì)胞作用[6-8]。由ePNP殺傷腫瘤細(xì)胞的原理,我們推測(cè)ePNP基因同樣可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。因此,本實(shí)驗(yàn)擬采用巨噬細(xì)胞特異表達(dá)的ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠,探究自殺基因ePNP聯(lián)合前體藥物fludarabine對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.自殺基因ePNP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細(xì)胞凋亡(1)實(shí)驗(yàn)分ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠組和野生型小鼠組,在體外培養(yǎng)的各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中分別加入濃度為0、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.Oμg/ml和2.0μg/ml的前體藥物氟達(dá)拉濱(fludarabine),采用活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞加藥后的細(xì)胞存活率。CCK-8檢測(cè)顯示給藥后ePNP小鼠腹腔巨噬細(xì)胞存活率明顯下降,尤其在濃度為2.0μg/ml,細(xì)胞存活率僅為(10.8±0.8)%。(2)給ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠腹腔注射劑量分別為0、10mg/kg、20mg/kg、60mg/kg的fludarabine,一天兩次,給藥五天,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)加入fludarabine后腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡情況。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示給藥后其腹腔巨噬細(xì)胞凋亡明顯增加,并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。(3)給ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠腹腔注射劑量分別為0、10mg/kg、20mg/kg、60mg/kg的fludarabine,一天兩次,共給藥五天,取材(肺、脾),采用原位凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL法)檢測(cè)加入fludarabine后組織巨噬細(xì)胞(肺、脾)的凋亡情況。TUNEL結(jié)果也顯示給藥后其肺、脾巨噬細(xì)胞凋亡明顯增加,并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系。CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法均顯示野生型小鼠給藥后沒(méi)有明顯巨噬細(xì)胞凋亡。結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.SR-A1-ePNP 小鼠和 APOE-/-小鼠雜交培養(yǎng) SR-A1-ePNP/APOE-/-將篩選出的SR-A1-ePNP轉(zhuǎn)基因純合子小鼠和APOE-/-小鼠雜交,獲得的F1代中,經(jīng)鑒定為ePNP陽(yáng)性的小鼠,繼續(xù)雜交,獲得的F2代中小鼠,采用普通PCR鑒定ePNP基因和APOE-/-基因。后代中ePNP陽(yáng)性和APOE基因敲除的小鼠即為目的小鼠。結(jié)論自殺基因ePNP能在前體藥物fludarabine協(xié)同作用下,誘導(dǎo)SR-A1-ePNP轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND AND OBJECTIVE Numerous studies have found that apoptosis of macrophages in advanced atherosclerosis (As) causes morphological changes of As plaque (especially the decrease of cap/nucleus ratio) and affects plaque vulnerability, resulting in plaque instability, which is an important cause of various cardiovascular diseases. Macrophage/foam cell apoptosis leads to the occurrence and expansion of extracellular lipid nuclei. Apoptosis residues can be found in the non-cellular part of the lipid nucleus [1-3]. Basis. In view of the conclusions of many previous studies, that is, the relationship between macrophage apoptosis and plaque rupture, from this relationship, if macrophage apoptosis can be successfully induced, then the same method can be used to induce apoptosis of intraplaque macrophages to establish Atherosclerotic Vulnerable Plaque model, thereby establishing a body. Therefore, we try to find a way to induce macrophage apoptosis to provide a basis for the later establishment of vulnerable plaque model similar to human As lesions. Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase (ePNP) gene has stronger cells. As a prodrug converting enzyme gene, ePNP can transform some adenine analogues, such as fludarabine, into metabolites with high toxicity and free penetration through cell membrane, thus producing toxic effects on cells and causing cell death. It was confirmed that ePNP suicide gene system had a good killing effect on tumor cells [6-8]. According to the principle of ePNP killing tumor cells, we speculated that ePNP gene could also induce macrophage apoptosis. Therefore, this study was designed to explore the effect of ePNP suicide gene combined with fludarabine on macrophages by using macrophage-specific expression of ePNP transgenic mice. The suicide gene ePNP induced apoptosis of macrophages in transgenic mice (1) The suicide gene ePNP induced apoptosis of macrophages in transgenic mice and wild type mice (1) The ePNP transgenic mice and wild type mice were divided into two groups. The mice peritoneal macrophages were cultured in vitro with 0,0.125 ug/ml, 0.25 ug/ml, 0.5 ug/ml, 1.O ug/ml and 2.0 ug/ml precursors, respectively. CCK-8 assay showed that the survival rate of peritoneal macrophages in ePNP mice decreased significantly, especially at the concentration of 2.0 ug/ml, and the cell survival rate was only (10.8 0.8)%. (2) The survival rate of ePNP transgenic mice and wild-type mice was small. The apoptosis of peritoneal macrophages was detected by flow cytometry after intraperitoneal injection of fludarabine at doses of 0,10 mg/kg, 20 mg/kg and 60 mg/kg twice a day for five days. Fludarabine of 0,10 mg/kg, 20 mg/kg and 60 mg/kg were injected into abdominal cavity of gene mice and wild type mice twice a day for five days. The apoptosis of macrophages (lung and spleen) was detected by in situ apoptosis assay kit (TUNEL). CCK-8, flow cytometry and TUNEL showed that there was no significant macrophage apoptosis in wild-type mice. The results were statistically significant. E-/-mice were hybridized and identified as ePNP-positive mice in the F1 generation. F2 generation mice were hybridized and identified as ePNP gene and APOE-/-gene by ordinary PCR. The ePNP-positive and APOE-knockout mice in the offspring were the target mice. Conclusion The suicide gene ePNP can induce SR-A1-eP in synergy with the precursor drug fludarabine. Macrophages apoptosis in NP transgenic mice.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R543.5

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本文編號(hào)：2212923