【摘要】：Salusins是2003年從編碼人類扭轉應力障礙基因TOR2A進行選擇性剪切的產(chǎn)物,包括28個氨基酸殘基組成的salusin-α和20個氨基酸殘基組成的salusin-β,salusin-a和salusin-β具有引起心動過緩和促血管平滑肌細胞有絲分裂作用。Salusin-a和salusin-β在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,salusin-β促進人巨噬細胞的泡沫化,而salusin-α具有相反的作用。在人動脈粥樣硬化斑塊組織中的血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)和成纖維細胞中主要表達salusin-β。本論文主要分為三個部分,分別探討了(1)salusin-β在VSMCs增殖、分泌纖維化分子及高血壓血管重構中的作用;(2)salusin-β在VSMCs遷移及血管損傷內(nèi)膜增生中的作用;(3)salusin-β在VSMCs泡沫化及單核細胞粘附性的作用。研究結果發(fā)現(xiàn)salusin-β在促進VSMCs的增殖、分泌纖維化分子、遷移、泡沫化和單核細胞粘附中起重要作用,提示salusin-β是干預高血壓、血管損傷、動脈粥樣硬化等血管重構性疾病的重要靶點之一。一、Salusin-β促進血管平滑肌細胞增殖和分泌纖維化分子以及在高血壓血管重構的作用1.背景VSMCs是血管壁結構的主要成分。VSMCs增殖和血管纖維化與很多臨床疾病密切相關,包括高血壓,動脈粥樣硬化、糖尿病及其重要靶器官損害。長期的血壓升高促進細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)在血管壁的合成與沉積,誘導血管硬化,加重高血壓的發(fā)展,從而形成一個惡性循環(huán)。高血壓血管病變主要表現(xiàn)為血管順應性降低、僵硬度增加和動脈管壁增厚,而血管壁的增厚根本原因主要是VSMCs的增殖。高血壓血管病變既是高血壓的重要病理改變,又是高血壓維持和發(fā)展的結構基礎,因此逆轉或抑制血管重構成為防治高血壓及靶器官損害的重要策略之一。但salusin-β在高血壓血管重構中是否發(fā)揮作用尚不明確,本研究主要探討salusin-β在VSMCs增殖和分泌纖維化分子的作用及下游信號通路。2.目的本研究探討了 salusin-β在人VSMCs增殖和纖維化中的作用及分子機制,并探討了大鼠salusin-β過表達對血管重構和血壓的影響。3.方法人的胸主動脈VSMCs培養(yǎng)在含體積分數(shù)為10%胎牛血清(FBS)的F12K Kaighn,s改良培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。CCK-8試劑盒(Cell counting kit-8 kits)檢測salusin-β對VSMCs的增殖作用,EdU摻入實驗檢測salusin-β對VSMCs的DNA合成速率的作用,流式細胞儀檢測VSMCs周期的分布。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定 salusin-β 和環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)水平,用蛋白質免疫分析技術(Western blotting)檢測總的和磷酸化的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinasl/2,ERK1/2),c-Jun 氨基端激酶(JNK),p38絲裂素活化蛋白激酶(p38),蛋白激酶A(ProteinkinaseA,PKA),cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和信號蛋白 smad2/3 的水平,磷酸化的組蛋白H3(Phosphorylated histone H3,P-H3),磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)。用 real-time PCR(RT-PCR)法檢測Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ),Ⅲ 型膠原(collagen-Ⅲ),轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的 mRNA 水平。大鼠尾靜脈注射慢病毒載體編碼salusin-β過表達基因,采用Powerlab尾動脈測壓系統(tǒng)測量清醒狀態(tài)下大鼠的尾動脈收縮壓(systolic arterial pressure,SBP),Masson 染色(Masson's trichrome staining)檢測主動脈、腎動脈和腸系膜動脈的血管重構情況。4.結果(1)Salusin-β劑量依賴性地促進VSMCs的增殖,在濃度為10nM、時間為48h時salusin-β的促增殖效應最明顯。Salusin-β減少GO/G1期的VSMCs的分布,增加S期的VSMCs和EdU陽性細胞數(shù)。(2)Salusin-β升高VSMCs的cAMP水平,并促進PKA的磷酸化,salusin-β的促VSMCs增殖效應被腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536預處理所抑制;Salusin-β促進ERK1/2的磷酸化,30min時ERK1/2的磷酸化水平最高,該效應被腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536、PKA抑制劑Rp-cAMP和EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1487所阻斷;salusin-β增加VSMCs的EGFR和CREB磷酸化水平,腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536、PKA抑制劑Rp-cAMP和EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1487抑制salusin-β誘導的CREB的磷酸化;腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536、PKA抑制劑Rp-cAMP預處理能降低salusin-β誘導的EGFR的磷酸化;腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536、PKA抑制劑Rp-cAMP、EGFR酪氨酸激酶抑制劑AG1487、ERK抑制劑U0126、CREB抑制劑KG501預處理阻斷Salusin-β引起的VSMCs增殖效應。(3)Salusin-β 刺激 VSMCs 的 collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、TGF-β1 和 CTGF 的 mRNA水平的升高,抗salusin-β抗體阻斷salusin-β的促血管平滑肌細胞分泌纖維化分子效應。(4)Salusin-β促進VSMCs的smad2/3的磷酸化,激活素受體樣激酶5(Activin receptor-like kinase 5,ALK5)抑制劑 A83-01 預處理阻斷 Salusin-β 誘導的collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ 和 CTGF 的 mRNA 水平的升高和 smad2/3 的磷酸化。(5)Salusin-β過表達大鼠的血漿、主動脈、腎動脈和腸系膜動脈的salusin-β水平顯著增加,salusin-β過表達大鼠的主動脈、腎動脈和腸系膜動脈的中膜厚度、中膜厚度與內(nèi)徑比值顯著升高,此外,salusin-β過表達大鼠的腎動脈和腸系膜動脈的內(nèi)徑也明顯減少,Masson染色顯示salusin-β過表達大鼠的血管外膜的厚度和膠原沉積也顯著增加。(6)Salusin-β過表達增加主動脈、腎動脈和腸系膜動脈中膜組織的EGFR、ERK1/2和CREB的磷酸化,但對JNK和p38無顯著作用;salusin-β過表達顯著增加主動脈、腎動脈和腸系膜動脈組織的增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和P-H3等細胞增殖標志物,此外salusin-β過表達大鼠的主動脈、腎動脈和腸系膜動脈也表現(xiàn)出collagen-Ⅰ、collagen-Ⅲ、TGF-β1和CTGF的mRNA水平的升高和smad2/3的磷酸化。(7)Salusin-β過表達引起劇烈和持久的血壓升高和心動過速;salusin-(3過表達3天,大鼠的尾動脈收縮壓開始升高,2周達到頂峰,一直持續(xù)到4周以上,過表達2周后心率也開始升高;麻醉情況下的平均動脈血壓(mean arterial pressure,MAP)和心率(heart rate,HR)進一步證實了salusin-β誘導的高血壓和心動過速效應。5.結論Salusin-β 通過 cAMP-PKA-EGFR-CREB/ERK 信號通路促進人 VSMCs 的增殖,通過TGF-β1-smad信號通路促進人VSMCs分泌纖維化分子,大鼠salusin-β過表達引起高血壓和血管重構。二、Salusin-β通過ROS/NFκB/MMP-9促進血管平滑肌細胞的遷移和血管損傷后的內(nèi)膜增生1.背景在生理情況下,VSMCs的增殖和凋亡處于動態(tài)平衡,而在病理情況下VSMCs會發(fā)生表型轉換,進而啟動增殖和遷移程序,在動脈粥樣硬化和經(jīng)皮冠脈介入術術后再狹窄等心血管疾病的發(fā)病中起關鍵作用。VSMCs由中膜遷移至內(nèi)膜引起的內(nèi)膜增生是動脈粥樣硬化和冠狀動脈成形術后再狹窄的主要原因,過去研究發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)等因素促進VSMCs的增殖和遷移,導致內(nèi)膜新生和增厚,導致血管再狹窄。因此尋找引起VSMCs增殖和遷移的重要靶分子成為治療動脈粥樣硬化和經(jīng)皮冠脈介入術術后再狹窄等心血管疾病的重要策略之一。Salusin-β是否在VSMCs遷移及血管損傷引起的內(nèi)膜增生中發(fā)揮作用還不清楚。2.目的本研究探討了 salusin-β在VSMCs遷移中的作用及分子機制,并探討了大鼠尾靜脈注射腺病毒載體編碼salusin-β的shRNA對血管損傷引起的內(nèi)膜增生的影響。3.方法酶消化法分離大鼠胸主動脈原代平滑肌細胞,采用8周的SD大鼠,單側頸動脈結扎法造成頸動脈損傷,蘇木素-伊紅染色(HE染色)對頸動脈進行病理檢測,免疫組化和免疫熒光檢測頸動脈salusin-β的表達,RT-PCR檢測待測樣品的MMP-9、MMP-2和salusin-β的mRNA水平,Western blot方法檢測待測樣品還原型煙酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶2(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase2,NOX2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase4,NOX4)、p65、IκBα、phosphor-IκBα、LaminB1、GAPDH、MMP-2 和 MMP-9 的蛋白表達,利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測待測樣品的salusin-β水平,transwell和傷口愈合實驗檢測VSMCs的遷移效應,脂質體(Lipofectamine 2000)轉染 siRNA,染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技術檢測NFκB在基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)啟動子的結合情況,Dihydroethidium(DHE)和 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCF-DA)作為超氧化物陰離子和過氧化氫熒光探針用來檢測活性氧變化。4.結果(1)結扎4周后的頸動脈呈現(xiàn)輕度的內(nèi)膜增生,8周以后內(nèi)膜增厚更加明顯;免疫組化和免疫熒光結果顯示正常頸動脈的salusin-β表達較低,且主要位于血管外膜,而損傷后的頸動脈上的salusin-β表達主要位于新生內(nèi)膜區(qū)域,損傷的頸動脈salusin-β的mRNA水平也明顯增加。(2)劃痕實驗和Boyden小室趨化試驗結果顯示salusin-β劑量依賴性地促進VSMCs遷移的數(shù)目和距離,當salusin-β濃度為10 nM時效應最強。(3)Salusin-β劑量和時間依賴性促進VSMCs的MMP-9蛋白和mRNA的表達,但對MMP-2的蛋白和mRNA水平無影響;此外salusin-β增強MMP-9啟動子的活性,抑制MMP-9能夠阻斷salusin-β引起的VSMCs遷移效應。(4)Salusin-β促進VSMCs的IκBα的磷酸化和降解,細胞漿的P65-NFκB表達下降,而細胞核的p65-NFκB表達明顯增加。(5)Salusin-β增加NFκB在MMP-9啟動子上的結合,抑制或下調(diào)NFκB減弱salusin-β引起的MMP-9的表達和VSMCs的遷移。(6)Salusin-β處理VSMCs上調(diào)NAD(P)H氧化酶2(NOX2)的蛋白表達,但對NOX4的蛋白水平影響不大,抑制NOX2可顯著降低salusin-β誘導的VSMCs活性氧的產(chǎn)生;NOX2-siRNA抑制salusin-β引起的MMP-9蛋白的水平升高和p65的核移位;應用活性氧清除劑或NAD(P)H氧化酶抑制劑apocynin也能阻斷salusin-β引起的MMP-9蛋白的增加、P65-NFκB的核移位和VSMCs的遷移效應。(7)尾靜脈注射腺病毒介導的salusin-β shRNA可有效降低血管損傷引起的內(nèi)膜增厚、內(nèi)膜與中膜的比值、MMP-9和NOX2的蛋白水平增加、活性氧增多等病理改變。5.結論Salusin-β促進大鼠VSMCs的遷移和血管損傷引起的內(nèi)膜增生,NOX2來源的活性氧是salusin-β引起P65-NFκB核移位的重要因素,進而正向調(diào)控MMP-9的活性和蛋白表達,引起VSMCs的遷移。salusin-β下調(diào)降低血管損傷引起的NOX2蛋白水平升高、活性氧產(chǎn)生及內(nèi)膜增厚,干預salusin-β可能成為治療動脈粥樣硬化和支架內(nèi)血管再狹窄等心血管疾病的重要策略之一。三、Salusin-β通過miR155/NOX2/NFKB促進人血管平滑肌細胞的泡沫化和單核細胞粘附1.背景VSMCs是泡沫細胞形成過程中必不可少的成分,泡沫細胞的形成是動脈粥樣硬化的標志,也是動脈粥樣硬化斑塊破裂的危險因素。過去認為巨噬細胞是泡沫細胞的主要來源,但近年來發(fā)現(xiàn)VSMCs也是泡沫細胞形成的主要成分。血液中的淋巴細胞細胞募集到血管也是動脈粥樣硬化發(fā)病過程中重要事件,是治療動脈粥樣硬化的潛在靶標之一。關于salusin-β在VSMCs泡沫化和單核細胞粘附性的作用并不清楚。2.目的本研究探討了 salusin-β在VSMCs泡沫化的作用及分子機制,并探討了salusin-β對VSMCs單核細胞粘附的作用及信號通路。3.方法人的胸主動脈VSMCs培養(yǎng)在含體積分數(shù)為10%胎牛血清(FBS)的F12K Kaighn's改良培養(yǎng)基中進行連續(xù)傳代培養(yǎng)。油紅O染色和酶法檢測VSMCs脂質沉積和膽固醇的水平,脂質體(Lipofectamine 2000)轉染siRNA,Western blot方法檢測待測樣品 NOX2、p65、ACAT-1、VCAM-1、LaminB1 和 GAPDH 的蛋白表達,RT-PCR檢測待測樣品的ACAT-1、VCAM-1和miR155的mRNA水平,染色質免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)技術檢測 NFκB 在ACAT-1和VCAM-1啟動子的結合情況,Dihydroethidium(DHE)作為超氧化物陰離子熒光探針用來檢測細胞的活性氧變化。4.結果(1)Salusin-β劑量依賴性和時間依賴性促進脂滴在VSMCs的積聚和單核細胞的粘附,當salusin-β濃度為30 nM處理48h時效應最大。(2)Salusin-β升高VSMCs的ACAT-1和VCAM-1的熒光素酶報告基因活性、蛋白和mRNA水平。下調(diào)ACAT-1阻斷salusin-β誘導的VSMCs脂質沉積和細胞內(nèi)總膽固醇含量升高,減少VCAM-1抑制salusin-β誘導的VSMCs的單核細胞粘附。(3)Salusin-β處理VSMCs劑量依賴性地促進P65-NFκB的核移位,增加NFκB與ACAT-1和VCAM-1啟動子的結合,NFκB抑制劑Bayll-7082消除salusin-β引起的ACAT-1和VCAM-1蛋白上調(diào)、VSMCs泡沫化和單核細胞粘附。(4)Salusin-β劑量和時間依賴性增加NOX2的表達和活性氧的產(chǎn)生,活性氧清除劑NAC、NAD(P)H氧化酶抑制劑apocynin或下調(diào)NOX2均阻斷salusin-β引起的ACAT-1和VCAM-1蛋白上調(diào)、VSMCs泡沫化和單核細胞粘附。(5)Salusin-β時間依賴性促進VSMCs的miRl55的表達,下調(diào)miRl55降低salusin-β引起的NOX2、ACAT-l和VCAM-1蛋白上調(diào)、活性氧的產(chǎn)生、p65-NFκB的核移位、VSMCs的泡沫化和單核細胞粘附性。5.結論Salusin-β上調(diào)人VSMCs的miR155的表達,引起NOX2來源的活性氧生成增多和P65-NFκB的核移位,NFκB激活促進ACAT-1和VCAM-1的蛋白表達,引起VSMCs泡沫化和單核細胞粘附,干預salusin-β可能成為治療動脈粥樣硬化血管病變的重要策略之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：2199512