本文關(guān)鍵詞：miRNAs and lncRNAs in vascular injury and remodeling，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中南大學》 2014年

長非編碼RNA H19在乳腺癌化療耐藥中的作用與機制研究

曲辰  

【摘要】：研究背景與目的 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。迄今為止,手術(shù)、放療、化療仍然是乳腺癌的主要治療手段。其中化療以其在手術(shù)前控制和縮小病灶,手術(shù)后防止復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等特殊作用而在乳腺癌綜合治療中占有不可替代的地位。但是幾乎不可避免的化療耐藥一直是有效控制乳腺癌的瓶頸。乳腺癌耐藥與乳腺癌患者復(fù)發(fā)及侵潤轉(zhuǎn)移相關(guān),但發(fā)生機制并未明確。因此研究乳腺癌耐藥機制,尋找新的耐藥標志物對于有效逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥,提高乳腺癌治療水平具有非常重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。 長非編碼RNA (Long no-coding RNA, LncRNA)是一類長度在200bp以上的非編碼RNA。許多研究顯示LncRNA可能參與到腫瘤發(fā)生發(fā)展、治療耐受等多種病理過程。本課題采用LncRNA基因芯片檢測了我們前期建立的5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥細胞系(MCF7/5FU)和親本細胞(MCF7) LncRNA表達差異,旨在構(gòu)建乳腺癌耐藥細胞與敏感細胞LncRNA差異表達譜,篩選和鑒定乳腺癌耐藥相關(guān)LncRNA,為闡述乳腺癌耐藥機制提供新的理論依據(jù)。 實驗方法 1.通過長非編碼RNA高通量基因芯片分析5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的乳腺癌多藥耐藥細胞(MCF7/5FU)與親代乳腺癌細胞(MCF7)之間的 長非編碼RNA表達差異.本項目受國家自然科學基金資助(基金資助號：81272450) 2.熒光實時定量PCR從MCF7/5FU及親代MCF7細胞和12例乳腺癌組織及配對癌旁組織驗證H19等片段的表達差異； 3.采用靶向H19的siRNA干擾MCF7和T47D細胞中H19的表達,實時定量PCR檢測干擾效果,MTS檢測H19干擾后細胞耐藥性變化； 4.構(gòu)建H19表達慢病毒感染H19低表達的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞,嘌呤霉素篩選后獲得H19穩(wěn)定高表達細胞系,MTS檢測其耐藥性變化； 5. Western blot檢測H19干擾和過表達細胞中EMT標志物的表達變化情況；Transwell實驗確定這些細胞侵襲性的變化； 6.實時定量PCR確定H19干擾的MCF7、T47D細胞、H19過表達的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞相對對照細胞miRNA200c的表達變化,western blot檢測miRNA200c的下游分子ZEB1的表達變化； 7.將miRNA200c抑制物導(dǎo)入H19過表達細胞,MTS、transwell和western blot檢測miRNA200c抑制物對H19表達的影響,確定miRNA200c在H19參與的調(diào)控過程中的作用； 8.染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)檢測H19干擾的MCF7、T47D細胞、H19過表達的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞相對對照細胞miRNA200c啟動子組蛋白H3乙�；淖兦闆r,確定H19對miRNA200c的表達調(diào)控機制； 實驗結(jié)果 1.基因芯片和實時定量PCR提示H19長非編碼RNA在藥物敏感乳腺癌細胞MCF7和藥物耐受乳腺癌細胞MCF7/5FU之間存在明顯的表達差異。在MCF7/5FU細胞中H19表達明顯下調(diào)。另外在先天耐藥的乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞中同樣存在明顯的H19表達下調(diào)； 2.H19的表達水平在乳腺癌組織中相對癌旁正常組織存在顯著的表達下調(diào)； 3.在藥物敏感的上皮表型乳腺癌細胞MCF7和T47D中干擾H19表達后這些細胞對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、紫杉醇等三種化療藥物的敏感性出現(xiàn)了一定程度的下降； 4.通過慢病毒表達載體在乳腺癌耐藥細胞系MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞中過表達H19,MTS實驗檢測發(fā)現(xiàn)這兩株細胞的耐藥性出現(xiàn)部分逆轉(zhuǎn)； 5.H19干擾的MCF7和T47D細胞EMT標志物表達出現(xiàn)變化,上皮標志物E-cadherin表達下調(diào),間充質(zhì)標志物Vimentin表達上調(diào),且侵襲性上升； 6.干擾H19表達的MCF7和T47D細胞中miR200c表達量下降,過表達H19的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞中miRNA200c表達量上升；且H19過表達的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞的EMT標志物出現(xiàn)變化,上皮標志物E-cadherin表達上調(diào),間充質(zhì)標志物Vimentin表達下調(diào),且侵襲性下降； 7.在H19過表達的MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)入miRNA200c抑制物后,這兩株細胞的耐藥性上升、侵襲性增強且上皮標志物表達下調(diào),間充質(zhì)標志物上調(diào)； 8. CHIP實驗顯示干擾H19后MCF7和T47D細胞miRNA200c啟動子區(qū)域組蛋白H3乙酰化水平下降,而過表達H19后MCF7/5FU和MDA-MB-231細胞miRNA200c啟動子區(qū)域組蛋白H3乙�；缴仙� 結(jié)論 1.H19長非編碼RNA為乳腺癌多藥耐藥的重要標志物,其表達下調(diào)是乳腺癌化療耐受和侵襲性增強的原因之一； 2.H19長非編碼RNA通過激活miRNA200c對抗乳腺癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)增加乳腺癌細胞藥物敏感性,降低細胞侵潤； 3.H19長非編碼RNA主要通過提高miRNA200c啟動子區(qū)域組蛋白H3乙�；蕉せ頼iRNA200c表達。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.9
【目錄】：

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