本文選題：硫化氫 + 一氧化氮��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：心血管疾病的發(fā)病原因及對(duì)機(jī)體的損傷已越來(lái)越受到臨床和研究的關(guān)注。在人群中,高血壓(hypertension)和高血脂(hyperlipidemia)是引起血管系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)原因,尤其是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)形成的重要危險(xiǎn)因素。隨著研究的進(jìn)行,一氧化氮(nitric oxide,NO),一氧化碳(carbon monoxide,CO),硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)被認(rèn)為是體內(nèi)的三種氣體信號(hào)分子,在多種系統(tǒng)發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用。NO一直被認(rèn)為是內(nèi)皮依賴性的舒張因子,是內(nèi)臟和全身血液循環(huán)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素。可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和心血管中樞活動(dòng)。抑制NO的產(chǎn)生可以劑量依賴性的使血壓升高并可引起相關(guān)的機(jī)體損傷,在大鼠使用L-NAME阻斷了NO的產(chǎn)生可引起脂代謝的代謝異常和升高膽固醇的水平,在高膽固醇血癥的模型上NO的降低可觀察的內(nèi)皮功能的損傷和動(dòng)脈粥樣硬化。H2S自發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直被認(rèn)為是一種毒性氣體。近年研究發(fā)現(xiàn)可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性生成。研究報(bào)道內(nèi)源性H2S對(duì)心血管系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),外源性應(yīng)用H2S可保護(hù)心臟的缺血再灌注損傷,H2S可以降低自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的血壓。但H2S對(duì)于肝臟的作用卻研究較少,已有研究發(fā)現(xiàn)H2S可以保護(hù)CCl4和門(mén)靜脈結(jié)扎所致的大鼠肝硬化損傷,H2S同樣可以保護(hù)肝臟的缺血再灌注損傷。應(yīng)用L-NAME導(dǎo)致的高血壓大鼠模型除了表現(xiàn)為血壓升高外還伴隨著血清脂質(zhì)和脂蛋白的異常。如能探明在肝臟中H2S與NO的關(guān)系以及內(nèi)源性H2S水平與心血管疾病危險(xiǎn)因素的關(guān)系,則可對(duì)心血管疾病的防治提供新的思路。第一部分硫化氫抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷和心血管風(fēng)險(xiǎn)目的:通過(guò)復(fù)制亞硝基左旋精氨酸(NG nitro-L-arginine methylester,L-NAME)誘導(dǎo)的大鼠模型并外源性給予H2S的供體硫氫化鈉(Na HS,sodium hydrosulfide)和格列苯脲(glibenclamide,Gli,KATP通道阻斷劑),以研究H2S對(duì)L-NAME所致的大鼠肝損傷的保護(hù)作用和心血管風(fēng)險(xiǎn)。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,動(dòng)物隨機(jī)分為6組,分別為:對(duì)照(con組),L-NAME組,con+格列苯脲組(con+Gli組),con+硫氫化鈉組(con+Na HS組),L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組,每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉(56μmol/kg)每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。各組大鼠每周測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓。大鼠給予處理5周后,留取血清和肝臟組織測(cè)量血清甘油三脂(TG,triglycerides),高密度脂蛋白(HDL,high-density lipoprotein),低密度脂蛋白(LDL,low-density lipoprotein),總膽固醇(CHO total cholesterol),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT,glutamic-pyruvic transaminase);通過(guò)顯微鏡觀察肝組織細(xì)胞排列,組織學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度,門(mén)管區(qū)結(jié)構(gòu),脂肪空泡出現(xiàn)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等。結(jié)果:1大鼠模型評(píng)價(jià):與con組大鼠相比,各組大鼠的食物攝入量和水的攝入量和體重隨實(shí)驗(yàn)周數(shù)逐漸增加,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組大鼠均未出現(xiàn)嚴(yán)重疾病、死亡的情況。2大鼠血壓的變化:在給予處理前各組的尾動(dòng)脈收縮壓無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在給予處理后,L-NAME組大鼠的尾動(dòng)脈收縮壓逐漸升高,L-NAME+Na HS組血壓較L-NAME組顯著降低。L-NAME+Na HS+Gli組血壓較L-NAME+Na HS組血壓升高,與L-NAME組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3肝功能指標(biāo)的變化:血清CHO和ALT各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。con組,con+Na HS組,con+Gli組的LDL和TG含量各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組LDL和TG較con組明顯升高,L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的LDL和TG較L-NAME組比明顯降低,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。con組,con+Na HS組,con+Gli組的HDL含量各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組HDL較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的HDL較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4肝臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察:肝臟組織HE染色后鏡下可見(jiàn)con組,con+Na HS組,con+Gli組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、完整,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周?chē)史派錉钫R排列。L-NAME組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,纖維結(jié)締組織增生,部分肝細(xì)胞體積增大、胞漿內(nèi)可見(jiàn)大小不等圓形空泡,部分肝細(xì)胞可見(jiàn)氣球樣變;中央靜脈周?chē)皡R管區(qū)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。L-NAME+Na HS組和L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織病理學(xué)變化介于con組和L-NAME組之間。小結(jié):本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME造成大鼠血壓的升高、肝臟的損傷和血清肝臟功能相關(guān)指標(biāo)的變化。應(yīng)用H2S的供體Na HS可以降低L-NAME誘導(dǎo)的大鼠血壓的升高并保護(hù)其肝臟的損傷,下調(diào)血壓的作用可以被KATP通道的阻斷劑格列苯脲阻斷,但苯脲阻斷不能阻斷H2S對(duì)肝臟的保護(hù)作用。第二部分硫化氫通過(guò)調(diào)節(jié)e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝臟損傷目的:復(fù)制L-NAME誘導(dǎo)的大鼠模型并外源性給予H2S的供體Na HS和格列苯脲(Gli),通過(guò)檢測(cè)血漿中NO和H2S以及使用分子生物學(xué)技術(shù)研究H2S保護(hù)L-NAME所致的大鼠肝臟損傷的作用機(jī)制。方法:健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只,動(dòng)物隨機(jī)分為6組,分別為:對(duì)照(con組),L-NAME組,con+格列苯脲組(con+Gli組),con+硫氫化鈉組(con+Na HS組),L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組,每組各6只。硫氫化鈉組大鼠采用硫氫化鈉(56μmol/kg)每日腹腔射;其余組大鼠每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水。L-NAME組大鼠給予配制好的L-NAME水溶液每日日常飲用。格列苯脲組大鼠給予配制好的格列苯脲水溶液每日日常飲用。大鼠給予處理5周后,留取血漿和肝臟組織測(cè)量血漿H2S的含量,測(cè)量肝組織中NO的含量,Western blot法檢測(cè)肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)。結(jié)果:1血漿H2S含量的變化:con組,con+Na HS組,con+Gli組的血漿H2S含量各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組血漿H2S較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的血漿H2S較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2肝臟組織NO的變化:con組,con+Na HS組,con+Gli組的肝臟組織NO含量各組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組肝臟組織NO較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織NO分別較L-NAME組比明顯升高,兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3肝臟組織蛋白表達(dá):結(jié)果采用目的蛋白的灰度值與內(nèi)部參照GADPH作比較。con組,con+Na HS組,con+Gli組的肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)各組之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)均較con組明顯降低。L-NAME+Na HS組,L-NAME+Na HS+Gli組的肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)均較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小結(jié):本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶的抑制劑L-NAME大鼠血漿H2S和NO含量降低,下調(diào)了肝臟組織e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白的表達(dá)。應(yīng)用H2S的供體Na HS可以上調(diào)L-NAME誘導(dǎo)的大鼠血漿H2S和NO含量,上調(diào)肝臟中與NO合成相關(guān)蛋白的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷,即不是通過(guò)KATP通道發(fā)揮的作用,可能是通過(guò)激活A(yù)KT-e NOS通路起到的。第三部分硫化氫通過(guò)調(diào)節(jié)e NOS/AKT抗L-NAME所致的大鼠肝細(xì)胞損傷目的:通過(guò)體外培養(yǎng)原代肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn),來(lái)探討H2S體外應(yīng)用是否可通過(guò)直接調(diào)節(jié)e NOS/AKT途徑而保護(hù)L-NAME所致的大鼠肝細(xì)胞損傷即通過(guò)調(diào)節(jié)e NOS/AKT的磷酸化上調(diào)肝臟細(xì)胞一氧化氮的生成。方法:肝臟細(xì)胞的分離和培養(yǎng)參Sprague-Dawley雄性大鼠通過(guò)門(mén)靜脈灌流消化液方法分離肝臟細(xì)胞,并采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法測(cè)定肝細(xì)胞活力。選取細(xì)胞活率在90%以上的肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。肝臟原代細(xì)胞分為對(duì)照組(con組),con+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組。藥物作用時(shí)間均為8小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清檢測(cè)NO的含量,采用NO的特異性熒光探針DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2',7'-difluorescein,diacetate)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)NO的變化,western blot法檢測(cè)肝臟原代細(xì)胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)。結(jié)果:1肝原代細(xì)胞生長(zhǎng)情況:本實(shí)驗(yàn)成功分離大鼠肝細(xì)胞,平均細(xì)胞活力92.5士0.68%.倒置顯微鏡下觀察,新分離的離體肝細(xì)胞為透亮圓形,呈單個(gè)分散狀態(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)2h后開(kāi)始出現(xiàn)貼壁、伸展現(xiàn)象,培養(yǎng)24h后大約90%的肝細(xì)胞完全貼壁,貼壁的肝細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣的多角形,胞體變平變薄,體積明顯增大,可見(jiàn)許多雙核細(xì)胞,細(xì)胞間開(kāi)始出現(xiàn)島狀連接。少數(shù)活力差的細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,換液時(shí)可以去除。培養(yǎng)2d后,貼壁生長(zhǎng)的肝細(xì)胞的形態(tài)改變更加明顯,肝細(xì)胞拉平、伸展,緊緊粘附于培養(yǎng)瓶底壁,相互融合,連接成片、島狀。2細(xì)胞上清中NO含量變化:con組,con+Na HS(100μmol/L)組的細(xì)胞上清中NO含量之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組細(xì)胞上清中NO含量較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組的細(xì)胞上清中NO含量較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細(xì)胞上清中NO含量與L-NAME組比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3細(xì)胞中NO含量的變化:con組,con+Na HS(100μmol/L)組的細(xì)胞中NO的生成較為相近。L-NAME組細(xì)胞中NO的生成較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組的細(xì)胞中NO的生成較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細(xì)胞中NO的生成與L-NAME組比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4細(xì)胞中相關(guān)蛋白的變化:Western blot法檢測(cè)肝臟細(xì)胞中e NOS,P-e NOSs1177,AKT,P-AKTs473蛋白表達(dá)。結(jié)果采用目的蛋白的灰度值與內(nèi)部參照GADPH作比較。各組的肝臟細(xì)胞中e NOS,AKT,蛋白表達(dá)各組之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。con組,con+Na HS(100μmol/L)組P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達(dá)各組之間均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME組細(xì)胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達(dá)較con組明顯降低。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)組,L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+Gli(100μmol/L)組細(xì)胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達(dá)均較L-NAME組比明顯升高,但兩組之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。L-NAME(100μmol/L)+Na HS(100μmol/L)+LY294002(20μmol/L)組細(xì)胞中P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白表達(dá)與L-NAME組比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小結(jié):本研究證實(shí)應(yīng)用NO合酶抑制劑L-NAME后大鼠肝臟原代細(xì)胞NO生成減少,此作用是通過(guò)下調(diào)肝臟細(xì)胞P-e NOSs1177,P-AKTs473蛋白的表達(dá)即減低了e NOS,AKT的磷酸化。應(yīng)用H2S的供體Na HS可以上調(diào)肝臟原代細(xì)胞NO的生成和相關(guān)蛋白的表達(dá)。這種調(diào)節(jié)作用不能被格列苯脲阻斷,可以被AKT的阻斷劑LY294002阻斷,表明H2S調(diào)節(jié)NO生成不是通過(guò)KATP通道發(fā)揮的作用;而是通過(guò)激活A(yù)KT-e NOS通路實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2066997