本文選題：神經(jīng)肽Y + 線粒體結(jié)構(gòu)　； 參考：《武漢大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：采用不同劑量的NPY對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行刺激,通過對心肌細胞活性、ATP含量、線粒體結(jié)構(gòu)、線粒體膜電位、PGC-1α蛋白及mRNA進行檢測,進而驗證NPY對原代培養(yǎng)大鼠心肌細胞的影響,從細胞層面研究應(yīng)激性心肌病的發(fā)病機理。方法：1.原代心肌細胞的培養(yǎng)與認定：利用聯(lián)合酶消化法獲得心肌細胞,通過差速貼壁法和添加BrdU純化心肌細胞,根據(jù)心肌細胞自主搏動的特性,實時錄像進行驗證,根據(jù)特殊標記物通過免疫組織化學(xué)方法進行特異性檢驗。2.原代心肌細胞功能性檢驗：用NPY對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行干預(yù)24小時后,用CCK-8試劑盒檢測心肌細胞的活性改變并用ATP試劑盒檢測ATP含量的變化。3.原代心肌細胞形態(tài)學(xué)檢驗：NPY對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行干預(yù)后,用JC-1試劑盒檢測線粒體膜電位的改變,熒光顯微鏡進行觀察；利用透射電鏡對干預(yù)后的原代大鼠心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)的變化進行檢測。4.原代心肌細胞分子學(xué)水平檢驗：NPY對原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞進行干預(yù)后,用Real-timePCR方法檢測PGC-1α mRNA、Western blotting方法檢鋇PGC-1α蛋白的改變,并對相關(guān)鈣離子通路(CaN.CaMKII、P38MARK)分別使用阻斷劑(環(huán)孢素A.KN-93.SB203580)進行阻斷實驗,為進一步信號傳導(dǎo)通路的研究提供參考。結(jié)果：1.經(jīng)過純化處理后的心肌細胞搏動良好,免疫組織化學(xué)標記物α-橫紋肌肌動蛋白和心肌肌鈣蛋白T呈陽性表達。2.經(jīng)過不同劑量NPY刺激后,原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞活性在不同時間點均有下降,顯示NPY對原代心肌細胞的活性有抑制作用,但與干預(yù)時間無顯著相關(guān)性；不同劑量的NPY干預(yù)后,原代培養(yǎng)的心肌細胞ATP含量明顯下降,呈劑量依賴性關(guān)系(P0.01)。3.經(jīng)過不同劑量NPY刺激后,原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞膜電位受到抑制并呈劑量依賴性關(guān)系；電鏡下,線粒體結(jié)構(gòu)改變明顯,包括線粒體腫脹、線粒體嵴的稀疏、融合、倒塌和破裂、線粒體內(nèi)部密度的改變以及異質(zhì)性物質(zhì)的出現(xiàn)等。4.經(jīng)過不同劑量NPY刺激后,原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞PGC-1α的mRNA和蛋白表達上調(diào),呈劑量依賴性關(guān)系。選擇性使用阻斷劑阻斷實驗,其中P38MAPK途徑(阻斷劑SB203580)表現(xiàn)陽性。結(jié)論：NPY能抑制原代培養(yǎng)的大鼠心肌細胞的能量代謝并使其活性降低,其機制可能是通過影響PGC-1α的mRNA和蛋白表達,進而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)的破壞和膜電位的彌散障礙,抑制細胞的能量代謝。因此,使用NPY對原代培養(yǎng)的心肌細胞進行干預(yù)的研究結(jié)果可為應(yīng)激性心肌病的動物模型提供參考依據(jù)。
[Abstract]:Aim: to stimulate primary cultured rat cardiomyocytes with different doses of NPY, and to detect the activity of ATP, mitochondrial structure, mitochondrial membrane potential, PGC-1 偽 protein and mRNA in primary cultured rat cardiomyocytes. Furthermore, the effect of NPY on primary cultured rat cardiomyocytes was verified, and the pathogenesis of stress cardiomyopathy was studied at the cellular level. Method 1: 1. Primary cardiomyocyte culture and identification: cardiomyocytes were obtained by combined enzyme digestion, purified by differential adherent method and added BrdU, and verified by real-time video recording according to the characteristics of cardiac myocyte pulsation. The specificity was tested by immunohistochemical method according to the special marker. Functional test of primary cardiomyocytes: after the primary cultured rat cardiomyocytes were treated with NPY for 24 hours, the activity of cardiomyocytes was detected by CCK-8 kit and the change of ATP content was detected by ATP kit. Primary cardiomyocyte morphology of primary cultured rat cardiomyocytes was examined by JC-1 assay. The changes of mitochondrial membrane potential were detected by JC-1 kit and observed by fluorescence microscope. The changes of mitochondria structure of primary rat cardiomyocytes after intervention were detected by transmission electron microscope (TEM). The molecular level of primary cardiomyocytes was assayed. After intervention of w / NPY on primary cultured rat cardiomyocytes, the changes of barium PGC-1 偽 protein were detected by PGC-1 偽 mRNAs and Western blotting. The blocking experiments were carried out on CaN.CaMKIIP38MARK by using cyclosporin A.KN-93.SB203580, which provided a reference for the further study of signal transduction pathway. The result is 1: 1. After purification, the cardiac myocytes had good pulsatility, and the immunohistochemical markers 偽 -rhabdomyactin and cardiac troponin T were positive. After stimulation with different doses of NPY, the activity of primary cultured rat cardiomyocytes decreased at different time points, indicating that NPY inhibited the activity of primary cardiomyocytes, but had no significant correlation with the time of intervention. The ATP content of primary cultured cardiomyocytes decreased in a dose-dependent manner. After different doses of NPY stimulation, the membrane potential of primary cultured rat myocardium was inhibited in a dose-dependent manner, and the mitochondrial structure changed obviously under electron microscope, including mitochondrial swelling, sparse mitochondrial ridge, and fusion. Collapse and rupture, changes in the density of mitochondria and the appearance of heterogeneous substances. 4. After different doses of NPY stimulation, the expression of mRNA and protein of PGC-1 偽 in primary cultured rat cardiomyocytes was up-regulated in a dose-dependent manner. The P38MAPK pathway (SB203580) was positive. Conclusion the effects of PGC-1 偽 on the expression of mRNA and protein in primary cultured rat cardiomyocytes may lead to the destruction of mitochondria structure and the diffusion of membrane potential, which may be due to the inhibition of energy metabolism and activity of primary cultured rat cardiomyocytes. Inhibit the energy metabolism of cells. Therefore, the results of intervention with NPY on primary cultured cardiomyocytes may provide reference for animal models of stress cardiomyopathy.
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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本文編號：1977175