本文選題：子宮內(nèi)膜干細胞 + 細胞凋亡��； 參考：《貴州醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:闡明子宮內(nèi)膜干細胞(endometrial stem cells,EnSCs)來源細胞因子“雞尾酒”(EnSCs derived cytokine cocktail,EdCC)的心肌保護效應與MEK/ERK信號通路的關(guān)系。方法:用人的EnSCs于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后更換培養(yǎng)液,以后每3d換液,生長融合達70%左右時進行傳代培養(yǎng),培養(yǎng)至第三代,用流式細胞術(shù)鑒定EnSCs表達間充質(zhì)干細胞表面標志物,然后通過Millipore技術(shù)從培養(yǎng)的EnSCs上清液中獲得EdCC,蛋白定量后供實驗用或-80℃冰箱儲存。用ELISA檢測EnSCs原培養(yǎng)液中EGF,以結(jié)扎冠狀動脈前降支的方式制備心肌缺血再灌注損傷模型。根據(jù)實驗需要通過小鼠尾靜脈注射不同劑量或不同凍存時間的EdCC及相應對照組試劑,再灌注24小時后用TTC/Evans blue染色小鼠I/R心肌,用image pro軟件計算其梗死面積。以7um厚度冰凍切片留樣,采用TUNEL染色和免疫熒光染色方法檢測其細胞凋亡情況,用Western blot檢測ERK1/2磷酸化水平和cleaved caspase-3表達。乳小鼠心肌細胞分為正常組、對照組和EdCC組,用過氧化氫(H2O2)造成氧化應激,檢測上清液乳酸脫氫酶(LDH)活性,同樣用TUNEL染色檢測細胞凋亡,DCFH-DA檢測細胞內(nèi)活性氧族(ROS)濃度。結(jié)果:1、體外培養(yǎng)的EnSCs貼壁生長,呈紡錘形,融合后形成旋渦樣結(jié)構(gòu)。經(jīng)流式細胞學分析,EnSCs表達間充質(zhì)干細胞表面標志CD90,不表達CD34和CD45造血細胞來源表面標志;用Millipore蛋白超濾技術(shù)可截留近90%EnSCs上清液中的EGF蛋白;2、每15ml EnSCs上清液經(jīng)Millipore超濾技術(shù)超濾濃縮后的體積為(200.5±11.2)μl,蛋白濃度為(5.57±0.95)μg/μl,EdCC的提取效率為每24h(222.4±29.3)μg/106細胞。3、-80℃長期儲存可導致EdCC蛋白濃度及總量逐漸降低;4、EdCC可以保護乳小鼠心肌細胞氧化應激所致細胞損傷及凋亡;5、EdCC減輕小鼠缺血再灌注損傷注射100μg為最佳劑量;5、-80℃長時間儲存降低EdCC心肌保護效應;6、EdCC可促進心肌ERK1/2磷酸化;7、EdCC介導的ERK1/2磷酸化可被PD98059阻斷;8、EdCC通過MEK1-ERK信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷;9、EdCC通過MEK1-ERK信號通路抑制細胞凋亡10、EGFR部分參與EdCC的心肌保護作用。結(jié)論:1、從培養(yǎng)人的EnSCs上清液中成功制備了可供直接使用的EdCC;2、該研究結(jié)果對目前成體干細胞治療模式從細胞轉(zhuǎn)移到細胞因子具有重要的理論意義;3、從組織壞死、細胞凋亡和凋亡蛋白表達三個方面驗證了EdCC對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。
[Abstract]:Aim: to elucidate the relationship between myocardial protective effect of endometrial stem cells (stem cells) derived from endometrial stem cell (endometrial stem cell) and MEK/ERK signaling pathway. Methods: human EnSCs was cultured at 37 鈩，

本文編號：1929271