本文選題：Krüppel樣因子15 + 心肌纖維化　； 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：背景與目的:心臟瓣膜疾病在成人心臟疾病中占很大比重,是造成心力衰竭的主要病因之一。慢性主動脈瓣狹窄是臨床常見的導致左心室超負荷的疾病,通過主動脈瓣膜置換解除流出道梗阻是典型的卸負荷過程。理論上瓣膜置換術后左心室壓力負荷解除,臨床癥狀應改善徹底,但部分患者心功能仍不能有效恢復,癥狀緩解不明顯,甚或有加重趨勢,并不能使患者受益。具體原因尚不明確,是否與心肌纖維化程度有關?壓力超負荷/卸負荷后心肌重塑決定心功能的恢復。心肌重塑是指在各種機械應力、代謝和遺傳的因素作用下產生的以包括心肌細胞肥大、間質纖維化、細胞間基質成分增加和細胞超微結構改變等為特征的病理生理過程。早期心肌肥厚是壓力超負荷作用下產生的適應性反應,它主要發(fā)生在長期壓力超負荷的情況下,心肌總量增加,收縮力增強,是一種有效的代償方式。然而,這種代償能力是有限的,當肥大心肌的需氧量得不到滿足時,心肌間質纖維化加重,最終導致心肌收縮功能障礙。在真核生物中,KLFs家族是基礎轉錄因子(BTEBP)中的一大類,它們參與早期的胚胎生長發(fā)育、細胞分化、組織器官的形成、原癌基因的突變和血管生成等生理病理過程,是真核生物中最大、最重要的一類基礎調控因子,這些KLF因子在生物體多種細胞類型中廣泛表達,發(fā)揮著各自不同的重要作用。既往針對此家族的眾多因子有過廣泛的研究,例如對KLF5基因敲除大鼠的研究顯示該因子在連續(xù)注射血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥厚、纖維化反應過程中是必不可少的;而且,在體外培養(yǎng)的心肌成纖維細胞中,KLF5基因直接調控了與組織重塑和傷口愈合有關的血小板起源的生長因子PDGF-A的轉錄;另外,在心肌成纖維細胞中特異性敲除KLF5基因,減輕了中等強度壓力超負荷所致心肌肥厚,是心血管重塑中的一個重要調控因子,在壓力超負荷心肌纖維化中起負向調節(jié)作用。而KLF15是已發(fā)現(xiàn)的17個KLFs家族基礎調控因子中的重要一員,它在細胞的生長、分化、凋亡等各個環(huán)節(jié)中起重要作用。綜合以上研究及發(fā)現(xiàn),我們認為心肌重塑導致的超微結構改變是影響心臟功能恢復的主要分子生物學事件,KLF15又是其中重要的關鍵因子。本課題擬建立有效的動物及細胞模型,在此動物和細胞兩個水平上探尋KLF15在心肌肥厚、纖維化中的具體調控機制。研究方法:本課題基于上述問題,采用在體、體外細胞實驗相結合的方法進行,主要分為以下四個部分:第一部分:采用野生型雄性sd大鼠,鼠齡3-4周,在非人工通氣的條件下,于主動脈瓣上、升主動脈處縮窄,建立了壓力超負荷心肌肥厚、纖維化動物模型,并在不同時間段解除縮窄制作卸壓力負荷模型;使用心臟彩色多普勒對該動物模型相關指標進行檢測,以明確造模效果。第二部分:利用大鼠非人工通氣升主動脈縮窄-松解模型,探尋不同時間點超負荷及完全卸壓力負荷后心肌病理改變和心肌纖維化轉歸特征,探討klf15基因在此過程中的作用,及其與tgf-β、ctgf、mrtf-a間的相互關系,了解klf15基因在壓力超負荷所致心肌纖維化的可能機制。第三部分:進行了大鼠心肌成纖維細胞的體外培養(yǎng),對培養(yǎng)的原代細胞做出了鑒定以及細胞增殖、凋亡情況的觀察,并在此基礎之上建立了tgf-β促體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞肥大模型,為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉歸的進一步具體分子機制研究提供細胞實驗平臺。第四部分:在體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細胞基礎之上,以所構建的tgf-β促細胞肥大模型為平臺,引入干涉和過表達klf15腺病毒載體并轉染,從細胞水平上探討了心肌纖維化及轉歸中的具體分子機制。研究結果:主要結果如下:1、我們利用sd大鼠在非人工通氣的條件下完成了升主動脈的縮窄及松解手術,通過心臟彩色多普勒檢測,從彩超圖像及相關測定數據結果中了解到:縮窄效果確切,縮窄后升主動脈直徑縮小約50%,橫截面積縮小約75%,縮窄遠端有較明顯擴張,縮窄后左室后壁、室間隔厚度增加明顯,而心臟射血分數、左室短軸縮短率、左室收縮壓明顯降低,左室舒張末壓明顯增加,而縮窄松解后,升主動脈直徑、心臟射血分數、左室短軸縮短率、左室收縮壓均有所恢復,室壁及室間隔厚度、左室舒張末壓均有不同程度降低。2、在大鼠非人工通氣升主動脈縮窄及松解動物模型中,主動脈瓣上縮窄后1周,即開始出現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化,隨縮窄時間延長,肥厚纖維化增加,tgf-β、ctgf、mrtf-a等細胞因子的mrna及蛋白表達水平逐漸增加,而klf15因子的mrna及蛋白表達水平卻逐漸減少;升主動脈縮窄后松解,心臟的各項指標(包括心室肥厚情況、心肌纖維化程度等)都有所改善,但早期(1W)、中期(3W)、晚期(6W)縮窄后松解組的恢復程度有一定差異,越早去縮窄的,各指標改善更為顯著。這說明心臟結構、功能的恢復程度與縮窄的持續(xù)時間有關。而TGF-β、CTGF、MRTF-A等細胞因子的mRNA及蛋白表達水平松解后有逐漸減少趨勢,KLF15因子的變化則相反,越早去縮窄越能更好的恢復并接近正常。3、通過對所培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞形態(tài)學觀察、免疫熒光鑒定、增殖及凋亡等生物活性檢測,我們可知該大鼠心肌成纖維細胞的體外培養(yǎng)方法可靠,操作簡便,細胞生長良好,純度高,可穩(wěn)定傳代;通過對Ⅰ型膠原mRNA水平的檢測結果分析,TGF-β確有促心肌成纖維細胞肥大、纖維化的作用,且效果明顯。4、所構建的KLF15過表達腺病毒及其干擾片段在體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細胞中有較高的轉染率,轉染效率與作用濃度和時間在一定范圍內也呈正相關。過表達KLF15腺病毒與心肌成纖維細胞轉染后,KLF15 mRNA和蛋白表達水平顯著提高,TGF-β、CTGF、MRTF-A的mRNA和蛋白表達水平明顯降低,其細胞肥大、纖維化減輕,Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量減少。而KLF15干擾片段與細胞轉染后,上述各指標變化均與之相反。結論:1、成功建立大鼠非人工通氣升主動脈縮窄/松解模型,該模型操作簡便,重復性好,經濟,為今后進行心肌壓力超負荷—卸負荷研究提供了良好的動物實驗平臺;2、在大鼠心肌成纖維細胞體外培養(yǎng)的基礎上,成功構建了TGF-β促細胞肥大模型,為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉歸的進一步具體分子機制研究提供了良好的技術手段和細胞實驗平臺;3、KLF15可通過反饋調節(jié)TGF-β,抑制CTGF及MRTF-A的作用,減輕心肌間質纖維化及心肌成纖維細胞表型轉變,從而改善心功能,在促心肌肥厚、纖維化中起關鍵的負性調控因子作用。4、KLF15對心肌纖維化作用的可能機制為:在壓力超負荷刺激時,心肌成纖維細胞在機械應力或化學因素的作用下,TGF-β表達增加,通過自(旁)分泌的形式作用于成纖維細胞,活化P38MAPK進而抑制KLF15的表達,一方面,低表達的KLF15失去對心肌成纖維細胞CTGF表達的抑制,促進心肌纖維化的發(fā)生;另一方面,低表達KLF15對心肌素相關轉錄因子A(MRTF-A)失去競爭性結合能力,MRTF-A通過SRF促進心肌成纖維細胞分化為肌成纖維細胞,促進間質纖維化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R542.2

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本文編號：1923416