發(fā)布時間：2018-05-15 00:08

  本文選題：Sema4D + 心力衰竭��； 參考：《蘇州大學》2016年博士論文

【摘要】：Sema4D是軸突導向分子Semaphorin家族成員,又被稱為CD100,其作用除了調節(jié)神經軸突導向、血管新生、腫瘤轉移外,在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮了重要作用。Sema4D是一個分子量150kD的跨膜蛋白,在免疫細胞和血小板中表達,目前對Sema4D的研究主要集中在其生理作用,其在病理過程中的作用和機制越來越受到重視。我們實驗室的前期結果表明Sema4D在血栓形成和心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,我們擬對其在其他心血管疾病如心衰和肥胖相關疾病中的作用進行進一步研究。目的:1研究Sema4D在心衰病人血漿中的水平和來源心力衰竭是各種嚴重心臟疾病的共同通路,死亡率與惡性腫瘤相仿,目前對于心力衰竭的治療方法非常有限,同時也需要一些簡便易行的診斷方法。免疫反應在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,有些炎癥因子可以作為心衰的診斷指標,如腫瘤壞死因子(TNF)等。Sema4D是表達在T細胞、血小板等表面的跨膜蛋白,具有活化T細胞和血小板的功能,在活化過程中可以被切割釋放出有活性的可溶性片段。因此我們推測Sema4D可能會參與心力衰竭過程,并且可以作為生物標志物用于心力衰竭的診斷,為了證明這一假設,我們將利用臨床樣本,(1)測定心衰病人血漿中可溶性Sema4D的水平;(2)研究Sema4D表達水平與心衰患者疾病嚴重程度的關系,探討其在心衰患者的診斷和疾病程度評估中的意義;(3)并初步探討心衰患者血漿Sema4D高表達的細胞機制。2研究Sema4D在肥胖和脂肪肝中的作用和機制肥胖是2型糖尿病和許多心血管疾病的主要風險因素,而脂肪組織的長期慢性炎癥反應是肥胖誘導相關疾病的重要原因。由于Sema4D在免疫細胞中的作用,我們推測Sema4D可能會通過活化T細胞等促進脂肪炎癥;同時由于Sema4D可以通過其受體PlexinB1調節(jié)Rho的活性,而Rho通路對于脂肪分化有重要調節(jié)作用,Sema4D也可能通過PlexinB1影響脂肪分化,參與肥胖相關疾病。為了證明我們的假說,我們利用基因工程小鼠以及高脂飼料誘導的肥胖和脂肪肝模型,(1)研究sema4d及其受體plexinb1在高脂飲食誘導的肥胖和脂肪肝中的作用;(2)初步探究sema4d和plexinb1調節(jié)高脂飲食誘導的肥胖和脂肪肝的分子機制。方法:1建立可溶性sema4d的elisa檢測方法,檢測正常人和心衰病人外周血中sema4d的水平⑴可溶性sema4d的elisa檢測方法的建立擴增含有his標簽標記的sema4d的細胞外段的psectag2b質粒,通過脂質體轉染至293t細胞,收集細胞培養(yǎng)上清,利用親和層析法分離純化上清中的sema4d蛋白,作為標準品。以可溶性sema4d蛋白作為抗原免疫小鼠,制備10株單克隆抗體,從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標記hrp。繪制標準曲線,建立夾心elisa方法。⑵正常人和心衰病人外周血中sema4d水平檢測收集126位正常人的edta抗凝外周血,離心取血漿。elisa方法測定血漿中可溶性sema4d的水平,分析不同性別和年齡的正常人外周血中sema4d的差異。通過流式細胞術和westernblot分析17β雌二醇對jurkat細胞和血小板表面sema4d表達的影響。收集157例心衰病人的edta抗凝外周血,離心取血漿,統(tǒng)計這些病人的基本資料包括年齡、性別、并發(fā)癥等。用建立的elisa方法檢測病人血漿中sema4d的表達,比較心衰病人和正常人血漿sema4d水平及其與年齡和性別的關系,并分析不同并發(fā)癥如糖尿病或者高血壓對心衰病人血漿中sema4d表達的影響。2心衰病人外周血t細胞、b細胞、血小板表面sema4d的表達。(1)通過ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心分離心衰病人(hf)和正常人(hd)外周血淋巴細胞,分別用cd3和cd19的抗體標記t細胞和b細胞,同時孵育sema4d抗體,流式分析t細胞和b細胞表面sema4d的表達情況。(2)流式檢測心衰病人和正常人外周血中cd4+t細胞和cd8+t細胞表面sema4d的表達。(3)通過同時孵育sema4d和cd41抗體,流式檢測正常人和心衰病人血小板表面sema4d的表達。3檢測sema4d敲除對高脂誘導的肥胖和脂肪肝的影響(1)收集2型糖尿病病人和正常對照的外周血漿,elisa方法檢測血漿中可溶性sema4d的表達水平;取正常飲食(chowdiet)和高脂飲食(hfd)的小鼠,取內臟脂肪組織提取rna,逆轉錄成cdna,實時定量pcr檢測sema4d及其受體plexinb1、plexinb2和cd72的表達。(2)每5-7天稱量高脂飲食喂養(yǎng)(8-10周)的wt和sema4d-/-小鼠體重,觀測小鼠的體重變化,同時檢測高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的脂肪含量以及血脂變化,以及葡萄糖耐受性。(3)取分別高脂喂養(yǎng)8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠肝臟,稱量,肝臟冷凍包埋盒石蠟包埋后切片,分別油紅o染色和he染色,顯微鏡下觀察和拍照,分析脂肪肝的嚴重程度。(4)取高脂飲食喂養(yǎng)8-10周的wt和sema4d-/-小鼠,分離生殖器脂肪組織細胞后,流式細胞分析兩組小鼠脂肪組織中炎癥細胞的浸潤,包括cd45+細胞、cd4+t細胞、cd8+t細胞、f4/80+巨噬細胞、cd11+m1型巨噬細胞的數(shù)量和比例的變化。4體外觀察sema4d對脂肪分化的影響取6-8周小鼠,分離脂肪組織,膠原酶消化后離心去除上層脂肪細胞,下層基質細胞培養(yǎng)3代后,流式檢測間充質干細胞特異性表面標志物的表達,并轉染對照和表達sema4d細胞外段的質粒,加入脂肪分化誘導劑,分化7天后油紅o染色觀察sema4d對脂肪分化的影響。5研究plexinb1敲除對高脂誘導的肥胖和脂肪肝的影響取wt和plexinb1-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8-10周,觀察小鼠的體重變化,脂肪含量,肝臟冷凍包埋后油紅o染色觀察脂肪肝的嚴重程度。結果:1測定并分析正常人和心衰病人外周血中sema4d的含量(1)可溶性sema4d含量檢測的elisa方法的建立為了測定心衰病人sema4d的表達,我們首先建立了夾心elisa方法。我們首先擴增了含有his標簽標記的sema4d的胞外段psectag2b質粒,通過脂質體轉染罰轉染至293t細胞,用親和層析法分離純化上清中的sema4d蛋白,sds-page電泳結果顯示其分子量在120kd作用,該蛋白作為標準品。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠,制備了10株單克隆抗體,從這10株單克隆抗體中篩選了兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標記hrp。并以該蛋白作為抗原免疫小鼠,制備了10株單克隆抗體,從中篩選兩株分別作為包被抗體和檢測抗體,檢測抗體標記hrp,建立夾心elisa方法。繪制標準曲線,建立夾心elisa方法,并得到了很好的標準曲線(r2=0.996)。(2)心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病人血漿中sema4d水平顯著增我們收集了126位正常人的edta抗凝外周血,離心取血漿。通過elisa方法測定可溶性sema4d的表達。結果顯示,不同年齡組sema4d表達沒有顯著差異,但正常男性(5.15±3.30ng/ml,n=63)較正常女性(4.19±2.39ng/ml,n=63,p0.05)sema4d表達顯著增加。此外,17β雌二醇能夠顯著抑制jurkat細胞表面sema4d的表達(p0.05),也能夠抑制collagen誘導的血小板sema4d切割。心衰病人外周血sema4d表達水平(8.94±5.89ng/ml)顯著高于正常對照(4.67±2.99ng/ml)(p0.0001)。但不同心衰分級、年齡對sema4d的表達沒有影響。男性心衰病人(9.26±6.35ng/ml,n=88)較女性心衰病人(8.54±5.26ng/ml,n=69)有增加的趨勢,但無顯著差異(p=0.19)。合并糖尿病(w/dm)的心衰病人(10.45±5.76ng/ml,n=40)較未合并糖尿病的心衰病人(w/odm)(8.42±5.87ng/ml,n=117)sema4d表達顯著增加。而是否合并高血壓(hp)對sema4d的表達無顯著影響。2心衰病人外周血t細胞和血小板表面sema4d表達水平變化。(1)心衰病人cd3+t細胞(p=0.002),包括cd4+t細胞(p=0.006)和cd8+t細胞(p=0.015)表面sema4d水平顯著升高,提示t細胞可能是心衰病人血漿中sema4d增加的一個重要來源。(2)心衰病人b細胞表面sema4d表達水平沒有變化(p=0.46),血小板表面sema4d雖然有增加的趨勢,但無顯著差異(p=0.188)。3sema4d敲除促進高脂飲食誘導的小鼠肥胖和脂肪肝。(1)糖尿病病人血漿中和高脂飲食的小鼠脂肪組織中sema4d表達增加。elisa檢測結果表明2型糖尿病病人較正常對照外周血中可溶性sema4d的表達水平顯著增加,此外喂食高脂飼料的小鼠脂肪組織中sema4d表達水平顯著增加(p0.05),而sema4d受體plexinb1(p0.05)和plexinb2(p0.05)表達則顯著下降,cd72表達無明顯變化。(2)sema4d敲除促進高脂飲食誘導的小鼠肥胖及胰島素抵抗。sema4d在高脂飲食小鼠脂肪組織中表達上調提示sema4d可能參與調節(jié)肥胖過程,為了證實這一假說,我們通過高脂飲食喂養(yǎng)的wt和sema4d-/-小鼠8-10周,持續(xù)監(jiān)測其體重變化,結果顯示雄性和雌性sema4d-/-小鼠分別較wt雄、雌小鼠體重均有顯著增加,sema4d-/-小鼠與wt相比的生殖器脂肪(genitalfat)(p0.01)和腎周脂肪(perirenalfat)(p0.01)占體重的百分比顯著增加。血脂檢測表明sema4d-/-小鼠空腹三脂酰甘油(tg)、tc、ldl-c較wt顯著增加,而hdl-c表達無明顯變化.此外,sema4d敲除顯著降低高脂飲食誘導的小鼠葡萄糖耐受性(p0.05)。(3)sema4d敲除促進高脂飲食誘導的脂肪肝。稱量高脂飲食16周后wt和sema4d-/-小鼠的肝臟和脾臟重量,結果顯示sema4d-/-小鼠較wt小鼠肝臟(p0.0001)和脾臟(p0.01)重量均有顯著增加。為了驗證sema4d對脂肪肝的作用,我們分別取高脂飲食8周和16周的wt和sema4d-/-小鼠的肝臟固定后石蠟包埋,組織切片,he染色分析各組小鼠的脂肪肝嚴重程度。結果顯示sema4d-/-組小鼠脂肪肝較wt小鼠更加嚴重。(4)sema4d敲除對高脂飲食條件下小鼠脂肪組織中炎癥細胞浸潤的影響。流式細胞儀檢測高脂飲食條件下wt和sema4d-/-小鼠內臟脂肪組織中炎癥細胞的數(shù)量和比例。結果顯示sema4d-/-較wt小鼠生殖器脂肪組織中cd45+白細胞(p=0.0009)、cd4+t細胞(p=0.02)、cd8+t(p=0.002)細胞和f4/80+巨噬細胞(p=0.02)的數(shù)量顯著增加。隨后我們分析不同炎癥細胞在脂肪組織的百分比,我們發(fā)現(xiàn)cd45+白細胞占所有細胞的百分比,以及cd4+t細胞、cd8+t細胞占cd45+白細胞的百分比均沒有顯著變化,cd45+白細胞占所有細胞的百分比有增加的趨勢,但無統(tǒng)計學意義(p=0.15)。cd4+t細胞(p=0.29)、cd8+t(p=0.09)細胞百分比也無明顯變化,這可能與sema4d有活化t細胞的作用有關。但是,f4/80+巨噬細胞(p=0.0005)、cd11+m1型巨噬細胞(p=0.02)占cd45+白細胞的百分比顯著增加。4sema4d體外抑制脂肪分化從脂肪組織中分離間充質干細胞,傳到第三代后,流式細胞分析儀檢測間充質干細胞marker(cd90和cd105)的表達。結果顯示分離的間充質干細胞不表達白細胞的markercd45,提示干細胞中沒有白細胞的污染,并且絕大多數(shù)細胞表達間充質干細胞的markercd90和cd105;隨后,我們將脂肪間充質干細胞接種于六孔板,分別轉染對照和表達sema4d細胞外段的質粒,待細胞長滿后加入脂肪分化誘導培養(yǎng)基,第七天取細胞進行油紅o染色,檢測脂肪分化效率。結果顯示轉染了sema4d的細胞脂肪分化明顯降低。5plexinb1敲除促進高脂誘導的脂肪肝。rt-pcr檢測plexinb1在骨骼肌、內臟脂肪、肝臟中的表達,已知表達plexinb1的腎臟作為陽性對照,結果顯示內臟脂肪和肝臟均表達plexinb1,但肝臟中plexinb1表達量較高,高脂飲食誘導后小鼠肝臟中plexinb1表達量明顯下降(p0.01)。剝離高脂飲食喂養(yǎng)wt和plexinb1-/-小鼠的生殖器脂肪和腎周脂肪,并拍照。與sema4d-/-類似,plexinb1敲除也促進高脂飲食誘導的肥胖。同樣,油紅o染色結果顯示plexinb1-/-小鼠脂肪肝顯著增加,realtime-pcr結果發(fā)現(xiàn)脂代謝相關基因ppar?1和ppar?2的表達也顯著上調。結論:1.心衰病人特別是合并糖尿病的心衰病人外周血中可溶性sema4d水平較正常人顯著增加,提示sema4d可能成為心衰病人生物標志之一。2.心衰病人血漿中可溶性sema4d含量增加與t細胞包括cd4+t細胞和cd8+t表面sema4d表達水平上調有關。3.sema4d敲除促進高脂飲食誘導的肥胖和脂肪肝。4.sema4對高脂飲食誘導的肥胖和脂肪肝的作用可能是通過其受體plexinb1介導的。5.Sema4D體外抑制間充質干細胞向脂肪的分化,可能參與高脂飲食誘導的肥胖過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54;R589.2

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本文編號：1890079