本文選題：再障 + 調(diào)節(jié)��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的研究重型再生障礙性貧血(Severe aplastic anemia,SAA)患者與正常人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Tregs)數(shù)量及功能的差異;探索并建立體外細(xì)胞培養(yǎng)體系,驗(yàn)證Treg細(xì)胞對其他免疫細(xì)胞數(shù)量與功能的影響,闡明在SAA發(fā)病過程中Treg細(xì)胞所扮演的角色,并為開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)。方法研究對象為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院自2014年1月至2016年1月收治的SAA初治患者、治療后恢復(fù)期(包括完全緩解與部分緩解)患者及正常對照者。第一部分采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SAA初治患者、SAA恢復(fù)期患者和正常對照者外周血CD4~+CD25~+CD127dim Treg細(xì)胞數(shù)量及功能分子T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原4(Cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4)、穿孔素(Perforin)、CD39、CD73、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein,GITR)、T細(xì)胞活化銜接因子(linker for activation of T cells,LAT)的表達(dá)情況,并與臨床造血與免疫指標(biāo)作相關(guān)性分析。第二部分免疫磁珠分選SAA患者和正常對照CD4~+CD25~+CD127dim Treg細(xì)胞及CD4~+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞(effective T cells,Teff),應(yīng)用CD3/CD28單抗包被的磁珠加上高濃度IL-2刺激,體外培養(yǎng)Tregs,分組比較細(xì)胞增殖情況,ELISA檢測培養(yǎng)基上清IL-10水平。將SAA患者/正常對照的Treg/Teff細(xì)胞混合交叉培養(yǎng),CCK-8檢測Teff細(xì)胞增殖,ELISA檢測培養(yǎng)基上清IFN-γ水平。第三部分免疫磁珠分選SAA患者和正常對照Treg細(xì)胞,實(shí)時熒光定量PCR檢測CTLA-4 mRNA的表達(dá)情況;體外誘導(dǎo)SAA患者骨髓單個核細(xì)胞成為樹突狀細(xì)胞(DC),將其分別與SAA患者、正常對照者的Treg細(xì)胞共培養(yǎng),流式細(xì)胞術(shù)分析DC表面CD80、CD86的表達(dá)。第四部分采用流式細(xì)胞術(shù)檢測SAA患者和正常對照Treg細(xì)胞腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)蛋白的表達(dá),免疫磁珠分選Treg細(xì)胞,實(shí)時熒光定量PCR檢測TRAIL mRNA的表達(dá)。結(jié)果第一部分初治組Tregs/CD4~+T百分比為(2.94±0.65)%,較恢復(fù)組(4.07±1.17)%和正常對照組(4.98±1.38)%顯著降低(P0.01);初治組Treg絕對細(xì)胞數(shù)量與恢復(fù)組、正常對照組相比也顯著下降(P0.01),完全緩解組與部分緩解組也有顯著差異(P0.01)。初治組Treg細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)率為(9.11±5.57)%,顯著低于正常對照組(15.00±8.30)%(P0.05);與Tregs百分比相乘后,初治組(0.26±0.16)%和恢復(fù)組(0.34±0.19)%較正常對照組(0.64±0.34)%下降更為顯著(P0.01)。初治組Tregs穿孔素的表達(dá)率為(3.80±2.54)%,略高于正常對照組(1.88±1.55)%和恢復(fù)組(2.78±2.52)%;與Tregs/CD4~+T%相乘后,初治組(0.10±0.06)%不再高于對照組(0.09±0.09)%。而Tregs CD39、CD73和GITR的表達(dá)率在三組之間均無明顯差異;但與Tregs/CD4~+T%相乘后,初治組均低于正常對照組。初治組、恢復(fù)組和正常對照組Tregs LAT表達(dá)率分別為(3.80±4.35)%,(2.77±3.41)%和(1.48±1.20)%;與Tregs百分比相乘后變?yōu)?0.11±0.11)%、(0.10±0.10)%和(0.09±0.09)%。SAA患者Tregs/CD4~+T%與中性粒細(xì)胞絕對值(r=0.533;P=0.000),血紅蛋白(r=0.337;P=0.024),血小板計(jì)數(shù)(r=0.355;P=0.017),及網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比(r=0.393;P=0.008)均呈正相關(guān)。第二部分分選后的Treg和Teff細(xì)胞的純度均在90%以上。體外培養(yǎng)8天后,Treg細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增約10倍,且純度仍保持在約60%。細(xì)胞生長曲線顯示初治患者Tregs甚至比恢復(fù)組和正常對照的增殖能力更強(qiáng)。初治組、恢復(fù)組和正常對照組外周血/骨髓的Treg細(xì)胞增殖倍數(shù)分別為(17.54±10.34)/(9.21±8.54),(8.05±5.67)/(11.29±18.28)和(6.14±8.80)/(3.71±2.84)。初治組、恢復(fù)組和正常對照組Treg細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中IL-10的濃度分別為(27.82±35.92)pg/ml,(44.98±64.30)pg/ml和(50.94±65.91)pg/ml。交叉培養(yǎng)后,Teff細(xì)胞的增殖率在(正常對照Teff∶正常對照Treg),(正常對照Teff∶SAA Treg),(SAA Teff∶正常對照Treg)和(SAA Teff∶SAA Treg)分別為(1.89±0.49),(1.86±0.61),(1.94±0.64),(1.90±0.64),無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。四組的培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度按以上順序依次為(25.87±24.07)pg/ml,(21.89±18.65)pg/ml,(15.63±9.35)pg/ml,和(10.16±5.52)pg/ml,(正常對照Teff∶正常對照Treg)組顯著高于(SAA Teff∶SAA Treg)組(P0.05)。第三部分初治組、恢復(fù)組和對照組Treg細(xì)胞內(nèi)CTLA-4 mRNA水平(2-ΔΔCt)分別為(1.32±1.05)、(1.00±1.46)和(1.73±1.42),其中恢復(fù)組顯著低于對照組(P0.05),初治組稍高于恢復(fù)組、低于對照組(P=0.48),趨勢與CTLA-4蛋白表達(dá)水平相一致。流式檢測SAA m DC單獨(dú)培養(yǎng)后CD80、CD86的表達(dá)率為20.43%、47.80%,SAA m DC∶SAA Treg共培養(yǎng)后CD80、CD86的表達(dá)率為18.33%、43.93%,SAA m DC∶正常對照Treg共培養(yǎng)后CD80、CD86的表達(dá)率為19.59%、45.98%。第四部分流式檢測初治組Treg細(xì)胞TRAIL的表達(dá)率為(23.83±12.19)%,有略高于恢復(fù)組(19.71±10.09)%和正常對照組(20.09±9.57)%的趨勢(P0.05),后兩者之間沒有差異。PCR檢測Treg細(xì)胞內(nèi)TRAIL mRNA水平,初治組、恢復(fù)組和對照組2-△△Ct分別為(44.07±81.56)、(108.51±253.19)和(15.50±36.23),趨勢與蛋白水平相一致。結(jié)論1、SAA患者CD4~+CD25~+CD127dim Treg細(xì)胞數(shù)量顯著減少,無論是相對數(shù)量還是絕對數(shù)量,且與各項(xiàng)臨床病情指標(biāo)呈顯著正相關(guān),經(jīng)過強(qiáng)化免疫抑制治療(IST)可得到明顯改善。2、SAA患者Treg細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)顯著減少,表明CTLA-4可能是SAA患者Treg異常的主要因素;穿孔素表達(dá)較高可能是一種代償,但由于Treg整體細(xì)胞數(shù)量不足,代償也不足。而CD39、CD73和GITR所介導(dǎo)的抑制機(jī)制、單個Treg細(xì)胞的存活能力、及LAT在Treg中所發(fā)揮的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能可能并未受損。3、SAA患者體內(nèi)的Treg細(xì)胞可被成功分離純化,且應(yīng)用CD3/CD28單抗的磁珠加高濃度IL-2可在體外成功擴(kuò)增Treg細(xì)胞;SAA患者的Treg甚至具有比正常對照更強(qiáng)的增殖能力;擴(kuò)增后的Treg可有效抑制Teff增殖及IFN-γ的分泌。4、Treg細(xì)胞表達(dá)的CTLA-4在體外對DC細(xì)胞CD80、CD86的表達(dá)有一定的下調(diào)作用,但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。5、SAA發(fā)病機(jī)制中,Treg細(xì)胞TRAIL介導(dǎo)的凋亡機(jī)制并不存在明顯缺陷。
[Abstract]:Objective To study the expression of CD4 ~ + CD25 ~ + CD127 dim Treg cells and CD4 ~ + CD25 ~ + CD127 dim Treg cells and CD4 ~ + CD25 ~ + CD127 dim Treg cells and CD4 ~ + CD25 - effector T cells in SAA patients and normal controls . The expression rate of T lymphocyte / CD4 ~ + T in primary treatment group was ( 3.80 鹵 4.35 ) % , ( 2.77 鹵 3.41 ) % and ( 4.98 鹵 1.38 ) % , respectively . The expression rate of TCD39 , CD73 and GITR in the first treatment group was ( 3.80 鹵 4.35 ) % , ( 0.10 鹵 0.10 ) % and ( 0.09 鹵 0.09 ) % , respectively . The concentration of IL - 10 was ( 27.82 鹵 35.92 ) pg / ml , ( 44.98 鹵 64.30 ) pg / ml and ( 50.94 鹵 65.91 ) pg / ml in the recovery group and normal control group , respectively . In SAA patients , the expression rate of CD80 and CD80 was 18.33 % , 43.93 % and SAA m DC were significantly higher than those of normal control group ( 23.83 鹵 12.19 ) % .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R556.5

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本文編號：1852975