本文選題：骨髓增生異常綜合征 + SPAG6基因　； 參考：《重慶醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的通過pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體靶向沉默SPAG6基因后,探討SPAG6基因與人骨髓增生異常綜合征(MDS)細胞凋亡的關系及其機制,為MDS的靶向治療奠定基礎。方法1.明確SPAG6-sh RNA慢病毒載體對人SPAG6基因干擾效率:將SPAG6-sh RNA及NC-sh RNA慢病毒轉染人MDS細胞株SKM-1細胞后,利用熒光顯微鏡觀察其表達情況,流式細胞術檢測其轉染效率,q RT-PCR及western blot驗證SPAG6基因是否被成功干擾。2.探索SPAG6基因的表達對TRAIL信號通路活化的影響:慢病毒轉染SKM-1細胞后,利用流式細胞術檢測細胞凋亡,western blot檢測TRAIL通路相關蛋白的表達情況。3.研究SPAG6基因與TRAIL凋亡通路之間的量的依賴性:同時利用不同濃度的r TRAIL蛋白處理SKM-1細胞,相同濃度r TRAIL蛋白分別處理SKM-1、U937及K562三種細胞,利用流式細胞術檢測細胞凋亡情況,CCK-8法檢測各組細胞增殖活性,western blot檢測TRAIL通路活化情況。4.探索SPAG6在TRAIL凋亡信號通路中的作用途徑及關鍵分子:采用q RT-PCR及western blot檢測TRAIL通路相關受體及蛋白的表達水平,免疫沉淀檢測二者的結合情況。結果1.SPAG6-sh RNA慢病毒成功轉染人SKM-1細胞。在熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光,流式細胞術檢測得其轉染率分別為(97.19±3.21)%與(88.31±12.81)%,QRT-PCR及Western blot結果顯示SKM-1細胞中SPAG6基因在m RNA及蛋白層面的表達均被成功抑制。2.SPAG6基因表達降低后,TRAIL凋亡通路被活化。干擾組的凋亡率明顯高于對照組(NC-sh RNA 8.65%±2.07%vs.SPAG6-sh RNA20.20%±2.11%,P0.05)。而且,SPAG6干擾組cleaved PARP、caspase-8以及cleaved caspase-8表達水平均升高,PARP表達則無明顯差異。同時,BAK、BAX、BID和caspase-3較對照組表達也明顯升高。3.SPAG6基因能抵抗r TRAIL蛋白引起的凋亡。隨著r TRAIL蛋白濃度的增加,SKM-1細胞凋亡率增加,增殖被抑制,且TRAIL通路活化的相關蛋白表達增加。而利用相同濃度的r TRAIL蛋白處理SKM-1、U937及K562時,在U937及K562中,細胞凋亡及增殖均無明顯區(qū)別。4.SPAG6能影響FADD與TRAIL通路受體間的相互作用。SPAG6基因表達被干擾后,FADD的表達較對照組明顯升高,而DR4及DR5的表達則無明顯區(qū)別。免疫沉淀的結果則表明,降低SPAG6表達后,FADD與DR4和DR5之間的相互作用明顯增加。結論SPAG6基因能夠通過影響TRAIL信號通路的活化調(diào)控SKM-1細胞的凋亡。其具體機制可能是細胞內(nèi)SPAG6基因的高表達能夠影響FADD的表達,進而致使FADD與TRAIL通路凋亡受體結合減少。
[Abstract]:Objective to investigate the relationship between SPAG6 gene and apoptosis of human myelodysplastic syndromes (MDS) cells by targeting SPAG6 gene silenced by pGC-SPAG6-shRNA recombinant lentivirus vector, and to lay a foundation for the targeted therapy of MDS. Method 1. To determine the interference efficiency of SPAG6-sh RNA lentivirus vector to human SPAG6 gene: after SPAG6-sh RNA and NC-sh RNA lentivirus were transfected into SKM-1 cell line of human MDS cell line, the expression of SPAG6-sh RNA lentivirus vector was observed by fluorescence microscope. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. Q RT-PCR and western blot were used to verify whether the SPAG6 gene was successfully interfered with. 2. 2. To explore the effect of SPAG6 gene expression on the activation of TRAIL signaling pathway: after lentivirus transfection into SKM-1 cells, apoptosis was detected by flow cytometry and the expression of TRAIL pathway related protein was detected by western blot. To study the quantitative dependence between SPAG6 gene and TRAIL apoptosis pathway: SKM-1 cells were treated with different concentrations of r TRAIL protein, and SKM-1 U937 and K562 cells were treated with the same concentration of r TRAIL protein, respectively. Cell apoptosis was detected by flow cytometry and the activation of TRAIL pathway was detected by western blot with CCK-8 assay. To explore the role and key molecules of SPAG6 in TRAIL apoptotic signaling pathway, Q RT-PCR and western blot were used to detect the expression of TRAIL receptor and protein, and immunoprecipitation was used to detect their binding. Results 1.SPAG6-sh RNA lentivirus was successfully transfected into human SKM-1 cells. A large amount of green fluorescence was observed under a fluorescence microscope, The results of flow cytometry showed that the transfection rates were 97.19 鹵3.21% and 88.31 鹵12.81%, respectively. The results of QRT-PCR and Western blot showed that the expression of SPAG6 gene at m RNA and protein level in SKM-1 cells was successfully inhibited. 2. The apoptosis pathway of trail was activated after the expression of SPAG6 gene decreased. The apoptosis rate of interference group was significantly higher than that of NC-sh RNA 8.65% 鹵2.07%vs.SPAG6-sh 20.20% 鹵2.11 in control group. Moreover, there was no significant difference in the expression of cleaved PARP caspase-8 and cleaved caspase-8 in SPAG6 interference group. At the same time, the expression of BAXBID and caspase-3 was significantly higher than that of control group. 3. SPAG6 gene could resist the apoptosis induced by r TRAIL protein. With the increase of the concentration of r TRAIL protein, the apoptosis rate of SKM-1 cells increased, the proliferation was inhibited, and the expression of related proteins activated by TRAIL pathway increased. However, when SKM-1U937 and K562 were treated with the same concentration of r TRAIL protein, there was no significant difference in apoptosis and proliferation between U937 and K562. 4. SPAG6 could affect the interaction between SPAG6 and the receptor of TRAIL pathway. The expression of SPAG6 gene in SKM-1U937 and K562 was significantly higher than that in the control group. However, the expression of DR4 and DR5 had no significant difference. The results of immunoprecipitation showed that the interaction between DR4 and DR5 increased significantly after the decrease of SPAG6 expression. Conclusion SPAG6 gene can regulate the apoptosis of SKM-1 cells by affecting the activation of TRAIL signaling pathway. The specific mechanism may be that the high expression of SPAG6 gene in cells can affect the expression of FADD, which leads to the reduction of FADD binding to the apoptotic receptor of TRAIL pathway.
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R551.3

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